郑世仲，江胜滔，刘伟，陈美霞，林玉玲，赖钟雄*，林金科

1. 宁德师范学院生命科学学院，福建 宁德 352100；2. 闽东特色生物资源福建省高校工程研究中心，福建 宁德 352100；3. 福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州350002；4. 福建农林大学安溪茶学院，福建 福州350002

茶树的表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate, EGCG）含量高于10%则可视为高EGCG茶树种[1]。茶树“1005”是由福建省高校农业生物技术重点实验室选育的高 EGCG茶树新品系，属于灌木型中叶种茶树。EGCG为类黄酮化合物，是茶叶品质的核心成分之一，也是茶多酚中最有效的活性成分，具有很强的抗氧化、抗癌、抗辐射、抗糖尿病、抗高血脂等功效[2-5]。虽然有关类黄酮化合物生物合成的基本途径已经探明，相关产物的组分变化也有相关报道[6-7]，但 EGCG生物合成的分子机制仍然比较模糊，转录因子对 EGCG生物合成的调控研究也相对较少。MYB类转录因子广泛存在于真核生物中[8-9]，在植物的次生代谢、器官形态构建、细胞周期和细胞分裂分化，甚至是环境胁迫应答等都具有重要的调控作用[8,10-11]。

启动子是基因转录的重要调控中心，位于基因5′上游侧翼区域，能与RNA聚合酶特异性识别和结合的一段DNA序列，是基因的一个重要组成部分，也是真核生物基因表达调控不可缺少的的组成部分，包含了多个上游顺式元件[12-15]。对启动子的深入研究，包括核心启动子序列的确定，调控元件的数量、类型及分布，将有助于我们更进一步探究该基因的功能和基因表达的调控机制，也有利于研究外源相关基因的表达调控。

本课题组经过前期的实验研究，以高EGCG茶树新品系“1005”及其父母本黄旦和福云七号为材料，利用高通量测序技术和相关软件分析，筛选出了与茶树 EGCG生物合成密切相关的一个 MYB转录因子，命名为CsMYB，并对CsMYB基因的克隆及其表达特性进行了深入的研究[16-17]，但对其发挥作用的信号途径和上游调控因子还不清楚。

本次研究拟在课题组前期的研究基础上，对CsMYB基因的5′侧翼调控序列进行分离克隆，对序列中含有的各类调控元件进行分析，并通过转化烟草的瞬时表达试验对其功能进行初步的验证，从而为进一步阐明CsMYB基因的上游调控网络、CsMYB基因在茶树EGCG合成过程中的时空表达特性、调控机制及其生物学特性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为福建省高校农业生物技术重点实验室选育的茶树“1005”新品系，采摘嫩芽后立即放入液氮中，并保存于-80℃的冰箱，用于茶树总DNA的提取。

1.2 试验方法

1.2.1 茶树基因组DNA的提取与CsMYB基因gDNA扩增

采用丁晓东等[18]改良的 CTAB法，提取茶树总DNA，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测。根据已克隆并登录NCBI的CsMYB基因 cDNA 核苷酸序列（KM079193.1）设计引物[17]，扩增CsMYB基因的gDNA全长序列。gDNA扩增上下游引物（gF、gR）见表1。

1.2.2CsMYB基因5′侧翼序列的扩增

采用染色体步移技术[19]对茶树CsMYB基因的 5′侧翼序列进行扩增。在CsMYB基因gDNA序列靠近5′端设计3条反向引物，进行3轮巢式 PCR扩增，PCR体系和程序参照Genome WalkingTMUniversal Kit（TAKARA）的试剂盒说明书进行设置。引物见表1。

1.2.3 PCR扩增产物的回收纯化、克隆与测序

PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，切割并用 GeneJET Gel Extraction Kit（Thermo Scientific）回收纯化目的片段，连接于pMD18-T Simple Vector（TAKARA），然后转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂板培养后挑选单克隆进行 PCR检测，选择阳性菌落送华大基因公司（深圳）测序。

1.2.4 启动子的生物信息学分析

克隆测序后，运用DNAMAN 6.0软件将获得序列结果与已知的序列进行比对拼接和分析；在线软件 Neural Network Promoter Prediction (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) 对分离得到序列的核心启动子区域及其转录起始位点进行分析预测；同时利用在线软件 PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html) 对启动子潜在顺式作用元件进行分析。

1.2.5茶树CsMYB基因启动子表达载体的构建

首先，克隆带有酶切位点BamHⅠ和NcoⅠ的目的片段 BamHⅠ-proMYB-NcoⅠ。通过DNAMAN 6.0软件分析启动子序列的酶切位点，结果显示CsMYB基因启动子序列不含有BamHⅠ和NcoⅠ酶切位点，启动子序列5′端和 3′端分别设计引入酶切位点BamHⅠ和NcoⅠ的上下游引物Pro-F和Pro-R，同时在引物5′端添加相应的保护碱基，设计的引物见表1。以启动子序列分析正确的步骤1.2.3将大肠杆菌菌液进行扩繁提取质粒，并以相应质粒为模板，利用高保真酶 KOD-Plus-Neo (code:KODo41)进行PCR扩增，回收纯化目的片段，克隆测序，序列比对正确后，产物命名为BamHⅠ-proMYB-NcoⅠ。

表1 CsMYB基因gDNA克隆、启动子克隆和载体构建引物Table 1 Primers for gDNA cloning, promoter cloning and vector construction

其次，构建含BamHⅠ-proMYB-NcoⅠ的重组表达载体。运用 FastDigestBamHⅠ和FastDigestNcoⅠ限制性内切酶（Thermo Scientific）分别双酶切上述步骤的纯化产物BamHⅠ-proMYB-NcoⅠ和 pCAMBIAl301空载体，并分别回收纯化酶切后的 BamHⅠ-proMYB-NcoⅠ和pCAMBIAl301的大片段。SolutionⅠ（TAKARA）连接纯化的两条片段，连接过夜后转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂板培养后选阳性克隆摇菌提取重组质粒。对提取的质粒进行双酶切以及用表1的特异引物（Pro-F/Pro-R）进行 PCR扩增双重检测。成功构建的重组表达载体命名为 p1301-proMYB-GUS。

最后，利用冻融法[20]将 p1301-proMYBGUS重组质粒和 pCAMBIA1301空载体分别转化农杆菌 EHA105感受态细胞，YEB培养基上涂板培养48 h后挑单菌落进行菌液PCR验证。

1.2.6重组质粒p1301-proMYB-GUS农杆菌菌液转化烟草的瞬时表达分析

参照Li等人[21]的方法，将步骤1.2.5验证后的阳性 EHA105用一次性针筒注射进入烟草（Nicotiana benthamiana）的叶脉中；25℃条件下光照/黑暗（14 h/10 h）培养3 d，用打孔器打孔取烟草叶片的菌液侵染部位，放入GUS染色液进行组织化学染色[22]，观察鉴定。以只携带 pCAMBIA l301空载体的 EHA105菌株侵染烟草作阳性对照，不携带任何载体的EHA105菌株侵染烟草作阴性对照。

2 结果与分析

2.1 CsMYB基因gDNA扩增与结构分析

在已知的CsMYB基因 cDNA序列的5′UTR和 3′UTR非编码区，分别设计上下游引物，以茶树总DNA为模板扩增CsMYB基因的gDNA全长序列，将克隆测序后的序列与相应的cDNA序列通过DNAMAN 6.0进行比对分析验证，最后得到CsMYB基因gDNA序列全长（从起始密码子到终止密码子）为1 828 bp。利用在线软件 GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)[23]和DNAMAN6.0对基因组序列进行基因结构分析，结果见图1，CsMYB基因组gDNA由2个内含子和3个外显子组成，两个内含子分别位于308～1 030和1 228～1 480，长度分别为 723 bp和 253 bp，AT量分别为67.1%和 70.7%，两个内含子的 5′端剪接供体分别为 AGG/GTATGA和 ATG/GTATTA，3′端剪接受体分别为 TAG/GA和 CAG/GT，两个内含子的长度均大于真核生物基因内含子最小长度 70 bp，且内含子剪切位点都符合真核生物经典的GT/AG规则[24]。

图1 CsMYB基因组结构Fig. 1 The structure of CsMYB gDNA

图2 CsMYB基因启动子电泳图Fig. 2 The electrophoretogram of the promoter of CsMYB

2.2 茶树CsMYB基因启动子的克隆

通过3轮的巢式PCR扩增，并通过单引物PCR验证，最后确定在1 100 bp左右的电泳条带可能为CsMYB基因的目的条带（图2）。回收纯化和克隆测序，目的条带实际长度为1 038 bp。

序列比对分析发现，扩增得到序列的 3′端与CsMYB基因gDNA序列5′端58 bp完全一致，同时与CsMYB基因的 cDNA序列的5′UTR末端108 bp也重叠吻合，结合NCBI-Blast分析表明，克隆得到的 1 038 bp序列为CsMYB基因上游5′端侧翼调控序列，命名为proMYB，结果见图3。proMYB序列与 gDNA序列一起登录 GenBank，登录号为KU133350.1。

2.3 茶树CsMYB基因启动子序列分析

Neural Network Promoter Prediction预测分析表明，该启动子序列存在预测峰值分别为0.91、0.99和0.51的3段核心启动子区域，分别位于 387～437、432～482 和 883～933，可能的转录起始位点分别为 A、C、A，分别位于第 427、472、923。在线软件 PlantCare对 ATG上游的调控序列进行分析，结果见图4，该启动子序列除了含有与提高基因转录水平相关的5′UTR Py-rich stretch顺式作用元件，启动子核心元件TATA-box和CAAT-box之外，同时还存在有赤霉素应答元件 P-box和TATC-box，水杨酸响应元件TCA-element，光响应元件Box 4、Box II和GT1-motif，厌氧胁迫诱导响应元件 ARE，冷害和脱水响应元件C-repeat/DRE，热激胁迫响应元件HSE；此外，该序列还含有大量功能未知或者功能特异的顺式作用元件。

2.4 茶树CsMYB基因启动子表达载体的构建

重组质粒进行双酶切和 PCR双重验证，结果见图5。双酶切得到的短片段以及用特异性引物扩增得到的目的条带，均与启动子片段大小一致，说明启动子表达载体重组质粒构建成功，命名为p1301-proMYB-GUS载体。

将 p1301-proMYB-GUS重组质粒转化EHA105农杆菌感受态细胞，涂板培养，用特异性引物进行 PCR检测，产物片段与启动子片段大小一致，说明 p1301-proMYB-GUS成功导入EHA105农杆菌，可以继续后续的试验研究。

图3 茶树CsMYB基因5′端侧翼序列Fig. 3 The 5′-flanking sequence of CsMYB

图4 CsMYB 5′侧翼序列顺式元件预测Fig. 4 Prediction of cis-acting elements of 5′-flanking sequence of CsMYB

图5 p1301-proMYB-GUS表达载体的构建与验证Fig. 5 Construction and verification of the expression vector of p1301-proMYB-GUS

2.5重组质粒p1301-proMYB-GUS转化烟草的瞬时表达分析

烟草叶片的GUS组织化学染色的结果见图6。阳性对照和 p1301-proMYB-GUS烟草叶片均有肉眼明显可见的蓝色，阴性对照未见蓝色。说明 proMYB启动子片段具有启动子的驱动功能，可以驱动下游GUS基因的表达。

图6 烟草叶片的GUS染色分析Fig. 6 Analysis of GUS histochemical staining of tobacco leaves

3 讨论

启动子的驱动活性影响着基因表达的时空顺序和基因表达水平[25]。因此，对基因启动子进行分离克隆和分析研究，可以阐述相应基因表达调控的分子机制和表达模式。本研究利用染色体歩移技术（Genome Walking）从茶树 DNA 中分离得到CsMYB的 5′侧翼序列proMYB（1 038 bp）转化烟草的瞬时表达试验结果表明，proMYB具有启动子的驱动功能，能够驱动下游基因表达。不同的启动子使基因表现出不同的表达模式，根据作用的方式差别，高等植物启动子通常可分为诱导型、组成型及组织特异性 3种类型的启动子[26]，序列分析表明，该序列含有相关激素应答和胁迫应答的顺式调控元件，初步推断proMYB启动子为诱导型启动子。

许多研究表明，ABA、SA、MeJA和GA3等多种外源激素可以调控植物的生长发育，它们在植物的细胞分裂与生长、病原菌防御、组织器官分化、次生代谢物质的合成与积累等方面具有重要作用[27-29]。Mundy等[30]研究表明，外源激素可以作为反式作用因子与启动子的相应调控元件结合进而调控该基因表达；相关研究也表明，GA3、MeJA、ABA和SA等植物激素对植物适应外界的环境胁迫具有一定的调控作用[31-34]。但是，顺式元件分析表明，我们分离得到的 proMYB序列却没有发现MeJA和 ABA顺式作用元件，这可能有两种解释：一是CsMYB5′端1 038 bp侧翼序列只是相应基因启动子的一部分，proMYB没有包含MeJA和ABA顺式作用元件；二是由于软件预测的局限性，proMYB序列存在未被发现的顺式作用元件。此外，proMYB序列含有多个功能未知的顺式元件，这些功能未知元件可能对相应基因的表达调控起一定的作用，但是这些元件作用的机制均有待进一步的研究。

顺式元件分析表明，proMYB含有对光、厌氧胁迫、冷害、热激胁迫和水分变化的响应元件，说明环境变化可以诱导茶树CsMYB基因的转录活性发生变化，目前，MYB作为植物最大的一个转录因子家族，在植物抗逆方面的调控作用已经被许多研究证实[35-37]。

植物对外界因素胁迫的耐受性大多受到多个基因控制，一个功能强大的转录因子也可以调控多个功能基因表达，大多数植物转录因子参与胁迫应答的途径主要有依赖ABA信号转导和不依赖ABA信号转导两种途径[38-39]，此外，转录因子的调控作用可能还受到其他转录因子的协同作用。本研究主要对CsMYB基因启动子进行克隆和功能分析，在启动子水平上初步鉴定了CsMYB基因功能，为进一步研究该基因在 EGCG生物合成过程的具体调控机制奠定基础。