卿玲杉，殷可欣，朱洁娜，陈鑫，王会芳，常丽新，唐红梅，贾长虹



加杨雄花序酸乳的研制及抗氧化性研究

卿玲杉1，殷可欣1，朱洁娜1，陈鑫1，王会芳2，常丽新1，唐红梅1，贾长虹1

（1. 华北理工大学 生命科学学院，河北 唐山 063210；2. 天津市蓟州区渔阳中学，天津 301900）

以加杨雄花序为辅料，利用保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌发酵生产新型酸乳。最终确定最佳工艺参数为：加糖量9%，加杨雄花序提取液料液比1:15，添加量10%。证明了该酸乳具有良好的抗氧化能力。达到50%清除率的酸乳上清液添加量和0.2 mg·mL-1的Vc添加量分别为，羟自由基：1.3 mL和2.0 mL；氧自由基：3.9 mL和0.8 mL；DPPH自由基：1.4 mL和1.8 mL；亚硝酸盐：1.3 mL和2.2 mL。该产品在0～4 ℃时的最佳饮用时间是7 d以内，货架期是21 d。

发酵；加杨雄花序；乳酸；自由基

杨柳科杨属的加拿大杨，又称加杨，原产于美洲，在我国作为绿化树木广泛种植。加杨雄花序具有很好的药用价值，可以抑制和杀灭细菌、抵抗炎症、增强机体免疫力等。在民间老百姓也常常利用加杨雄花序，做出各种美味食品。市场上各式各样的酸乳，备受男女老幼的喜爱。这是因为，酸乳丝滑爽口、气味芳香、颜色诱人，且其含有的乳酸菌可以改善肠道菌群；发酵过程中从乳糖到乳酸的转化，可降低“乳糖不耐受症”的发生；其美容养颜、提高免疫力等效果也彰显出来。对酸乳日趋高质量、高数量的需求，促使开发新型酸乳势在必行[1-2]。加杨雄花序中含有黄酮类化合物，可以有效清除亚硝酸盐和自由基，但目前文献报道的有关加杨雄花序的开发利用研究不多[3,4]。

本实验室已经具有对加杨雄花序黄酮的提取、纯化及功能研究基础，本实验力求开发新的酸乳产品，将加杨雄花序加入酸乳之中，实现二者营养和保健的完美集成。

1 材料和设备

1.1 材料

加杨雄花序：每年的3月20日左右采自原华北理工大学校园。

菌种：保加利亚乳杆菌/嗜热链球菌=1:1，购于哈尔滨乳业工程技术中心。

鲜牛奶：市售蒙牛纯牛奶。

添加剂：市售优质白砂糖。

药品：盐酸奈乙二胺、DPPH、对氨基苯磺酸、亚硝酸钠、CMC、无水乙醇、酚酞。

1.2 主要设备

HJ-CJ-2D型超净工作台（上海苏净实业有限公司）、BCD-321WDCC型冰箱（海尔集团）、KDF-2311型达康多功能食品粉碎机（天津达康电器有限公司）、SPX-50B生化培养箱（北京市恒诺利兴科技有限公司）、SH2147电磁炉（美的集团）。

2 实验方法[5-7]

2.1 发酵剂的制备流程

牛奶（第一代注意脱脂）→杀菌（121 ℃，0.1 Mpa，5 s）→冷却（42 ℃左右）→接种→发酵（42 ℃左右，使酸度达75±5 ºT）→冷藏后熟（2 ℃～4 ℃，16~24 h）→传代（5~6代）。

2.2 加杨雄花序汁提取

2.2.1 工艺路线

加杨雄花序→烘干、粉碎→浸提→离心→提取液。

2.2.2 操作要点

（1）烘干粉碎：将加杨雄花序洗净，在95 ℃鼓风干燥箱中放置15 min，使酶失活，防止酶催化产生褐色物质；再于65 ℃烘干至脆，该温度可以尽量使加杨雄花序中的有效成分保留；

（2）粉碎过筛：将烘干的加杨雄花序放到粉碎机中，处理30 s，过筛选120目的颗粒用于实验；

（3）浸提：用去离子水作浸提液。杨树花粉末→45 ℃，60 min浸提→4 000 rpm，10 min离心→冷却。

2.3 杨树花酸乳的加工

2.3.1 酸乳发酵工艺

本实验室优化的酸乳发酵工艺流程和参数已经成型，本文按照该方法进行：

新鲜牛奶→加9%蔗糖→加0.07%的CMC为稳定剂→95 ℃，5 min下灭菌→降温至42 ℃以下→接种（4.5%）→发酵（42 ℃，4.0 h）→添加加杨雄花序汁→搅拌→无菌灌装→后熟→成品。

2.3.2 加杨雄花序添加试验

考虑到浸提液料液比（g·mL-1）以及浸提液添加量对酸奶成品影响较大，设计如表1试验。

表1 加杨雄花序汁浸提和添加试验

说明：编号为所对应的产品。如①号表示料液比为1:5，加杨汁添加量占成品总量的10%。

2.4 正交实验

表2 加杨雄花序酸乳正交实验因素水平表

设计L9(34)正交试验。四个因素为A加糖量（%）；B加浸提液（%）；C接种量（%）；D发酵时间（h）。选取三个水平的数据，参考本实验室优化的参数，方案列于表2。

2.5 酸奶品质的测评方法

2.5.1 酸度测定

样品10 mL（至于锥形瓶）→加20 mL蒸馏水→混匀→加5滴0.5%酚酞酒精→用0.1 mol·L-1NaOH滴定→至粉色（30 s内不消失），用NaOH的体积数乘以10得到酸度（ºT）。

2.5.2 感官评价标准

评价小组由20人组成，依据表3的感官评价标准对酸奶进行评价，取平均值作为结果。

表3 加杨雄花序酸乳感官评价标准

2.5.3 酸奶货架期的确定

将4 ℃冰箱中保存的酸乳，每隔24 h观察乳清析出量和分层情况，同时测定酸度。

2.6 抗氧化性实验

实验样品制备：酸乳（按7:3样水比例稀释）→混匀→离心（4 000 rpm，10 min）→上清液。

为了明确实验效果，以0.2 mg·mL-1的Vc作为对照。

2.6.1 羟自由基清除实验

采用水杨酸法[8]：水杨酸-乙醇（95%）2.0 mL（5 mmol·L-1）+ FeSO41.0 mL（10 mmol·L-1）→混匀，分别加入酸乳上清液0.2、0.5、1.0、1.5、2.5、4.0 mL→加入去离子水，使总体积为7 mL→混匀，加2 mL H2O2（10 mmol·L-1）→37 ℃保温30 min→510 nm测吸光值。以0.2 mg·mL-1的Vc代替酸乳上清液进行对照实验。

按下式计算清除率：

(%)=[0-(n-n')]/A0×100 (1)

0、n、n'分别为空白对照液、加入酸乳上清液和VC后、不加H2O2时酸乳上清液的本底对应的吸光值。

2.6.2 氧自由基清除实验

采用邻苯三酚法[9]：3.0 mL的pH 8.2的Tris-HCl，分别加入酸乳上清液0.2、0.5、1.0、1.5、2.5、4.0 mL→加入去离子水，使总体积为7 mL→混匀→25 ℃，20 min→加1.0 mL邻苯三酚（7 mmol·L-1）→混匀→5 min后测325 nm处吸光值。以0.2 mg·mL-1的Vc代替酸乳上清液进行对照实验。按下式计算清除率：

(%)=(0-n)/0×100 (2)

0、An分别为空白对照液，加入酸乳上清液和VC后对应的吸光值。

2.6.3 DPPH清除实验

酸奶上清液0.1、0.5、1.0、1.5、2.5、3.0 mL+去离子水补至6 mL→混匀→加DPPH乙醇溶液3 mL（120 μmol·L-1）→混匀→静置30 min（避光）→测吸光值（517 nm）。以0.2 mg·mL-1的Vc代替酸乳上清液进行对照实验。按(2)式计算清除率。

2.6.4 酸乳对亚硝酸盐的清除作用

采用重氮偶合比色法[10]：酸奶上清液0.1、0.5、1.0、1.5、2.5、3.0 mL+ NaNO2标准溶液2 mL（8µg/mL）→加离子水，使总体积为5 mL→混匀→静置1 h→加对氨基苯磺酸2 mL（0.4%）→混匀→静置5 min→加盐酸奈乙二胺1 mL（0.2%）→混匀→静置15 min→测吸光值（540 nm）（本底为参比）。以0.2 mg·mL-1的Vc代替酸乳上清液进行对照实验。按(2)式计算清除率。

3 结果与分析

3.1 加杨雄花序提取液添加实验

将三种不同料液比（1:5、1:10和1:15）的加杨雄花序提取液按照10%、15%和20%分别加到酸乳中，得到表4的结果。可见，采用料液比为1:15，添加量为15%的产品评分最高，为81.5。观察产品，发现其具有柔和典雅的浅咖啡色、有酸乳和加杨雄花序混合后特有的清香、无分层、具有均匀的粘度、滋味纯正。

表4 加杨雄花序汁添加试验口感品评

3.2 杨树花汁添加实验

正交试验如表5所示。可见，四因素对酸乳质量的影响大小为：C>A>B>D，即加糖量>加杨雄花序提取液添加量>发酵时间>接种量；最优水平的A2B1C2D3为加糖9%，添加10%加杨雄花序汁，按照4%加入生产菌种，发酵4.5 h。

表5 正交实验结果表

以最佳条件发酵得到的加杨雄花序酸乳，酸度为75.8 ºT，感观品评得分为91.6。

3.3 酸奶货架期

通过观察加杨雄花序酸乳的组织状态和稳定性，同时测定酸度，考察21 d，结果如表6所示。可见，酸度增加较快出现在9 d后，21 d时，接近110 ºT；从颜色看，7 d后，酸乳颜色由深至浅；从组织状态分析，7 d后出现分层和乳清。综合性分析，加杨雄花序酸乳最佳饮用时间是7 d内，货架期是21 d。

表6 成品稳定性实验

3.4 抗氧化性实验

3.4.1 酸乳清除羟自由基

图1 酸乳清除羟自由基

图1为加杨雄花序酸乳清除羟自由基的效果以及VC的对照试验。

由图1可见，对羟自由基清除率随酸乳上清液加入量加大而增加。清除率从2%提高到37%的上清液加入量为0.2 mL和1.0 mL；当清除率为85%时，添加量为4.0 mL；当加入量小于1.0 mL时，上清液的作用低于0.2 mg·mL-1的Vc；但当加入量大于1.0 mL时，作用高于Vc；酸乳上清液和Vc添加量为1.3 mL和2.0 mL时，可达到50%清除效果。

3.4.2 酸乳清除氧自由基

图2为加杨雄花序酸乳清除氧自由基的效果以及VC的对照试验。可见，对氧自由基清除率随酸乳上清液加入量加大而增加。清除率从5%提高到8%的上清液加入量为0.2 mL和1.5 mL，上升不明显；清除率为31%的添加量为2.5 mL，上升幅度较大；当添加量为4.0 mL时，清除率为54%。与0.2 mg·mL-1的Vc比较，清除率均低于Vc。酸乳上清液和Vc添加量为3.9 mL和0.8 mL时，可达到50%清除效果。

图2 酸乳清除氧自由基

3.4.3 酸乳对DPPH的清除作用

图3 酸乳清除DPPH自由基

从图3可见，对DPPH自由基清除率随酸乳上清液加入量加大而增加。清除率从11%提高到52%的上清液加入量为0.1 mL和1.5 mL，上升明显；清除率为61%和83%的添加量分别为2.5 mL和3.0 mL；与0.2 mg/mL的Vc比较，清除率均高于Vc。酸乳上清液和Vc添加量为1.4 mL和1.8 mL时，可达到50%清除效果。

3.4.4 酸乳清除亚硝酸盐

图4为加杨雄花序酸乳清除亚硝酸盐的效果以及VC的对照试验。可见，对亚硝酸盐的清除率随酸乳上清液加入量加大而增加。清除率从21%提高到54%的上清液加入量为0.1 mL和1.5 mL，提高明显；与0.2 mg·mL-1的Vc比较，清除率高于相同加入量对照；清除率从60%提高到66%的加入量分别为2.5 mL和3.0 mL，与0.2 mg·mL-1的Vc比较，清除率低于相同加入量对照。酸乳上清液和Vc添加量为1.3 mL和2.2 mL时，可达到50%清除效果。

图4 酸乳清除亚硝酸盐

4 结论

（1）加杨雄花序酸乳的生产工艺为：新鲜牛奶（100 mL）加蔗糖（9 g）→灭菌（95 ℃，5 min）→接入4%的发酵剂→42 ℃恒温发酵（4.5 h）→加10%的加杨雄花序提取液→后发酵（0~4 ℃，24 h）。

（2）酸乳上清液和0.2 mg·mL-1的Vc加入后，得到50%清除效果的量分别为，羟自由基：1.3 mL和2.0 mL；氧自由基：3.9 mL和0.8 mL；DPPH自由基：1.4 mL和1.8 mL；亚硝酸盐：1.3 mL和2.2 mL。

（3）新型加杨雄花序酸乳具有酸乳的芳香和加杨雄花絮的特有清香，集两者营养于一体，可为开发市场新产品提供理论依据。

（4）该产品在0～4 ℃时的最佳饮用时间是7 d以内，货架期是21 d。

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Study on Preparation ofMoench Beverageand Antioxidation

QING Ling-shan1, YIN Ke-xin1, ZHU Jie-na1, CHEN Xin1, WANG Hui-fang2, CHANG Li-xin1, TANG Hong-mei1, JIA Chang-hong1

(1. College of Life Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China; 2. Yuyang Junior High School Jizhou District, Tianjin 301900, China)

UtilizingMoench as supplemental material, milk is fermented where Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus are added. The optimum fermentation conditions are as follows: the sugar amount is 9%,Moench extraction ratio of solid to liquid is 1:15, and adding of that is 10%. The yoghurt has better capacity of antioxidation. The best technical parameters are as follows: the adding of supernatant that radical-scavenge is up to 50% and 0.2 mg·mL-1Vc is 1.3 mL and 2.0 mL on hydroxyl radicals (·OH), 3.9 mL and 0.8 mL on oxygen radicals (O2-·), 1.4 mL and 1.8 mL on DPPH radicals, and 3.9 mL and 0.8 mL on nitrous acid (HNO2) respectively. The optimal drinking time of the product at 0 ~ 4 ℃ is less than 7 days, and the shelf life is 21 days.

fermentation;Moench; lactic acid; free radicals

Q5-33

A

1009-9115(2018)06-0077-05

10.3969/j.issn.1009-9115.2018.06.018

华北理工大学大学生创新实验项目（X2014134/X2015277）

2017-04-19

2018-09-20

卿玲杉（1992-），女，四川成都人，研究方向为天然产物的提取及活性研究。

贾长虹（1966-），女，辽宁义县人，硕士，教授，硕士生导师，研究方向为天然产物的提取及活性研究。

（责任编辑、校对：李春香）