陈踊南，叶日英，陈俏纯，陈慧珍，罗敏敏，陈欣

(广东海洋大学 食品科技学院，广东 湛江 524088)

腌鱼由于具有独特的风味而倍受人们青睐，且加工方法简单、成本低廉，在鱼类加工业中占有较大比重，是远洋捕捞及个体较小的鱼多采用的加工方式。鱼在腌制过程中，部分蛋白质被分解为游离氨基酸，细菌使其产生脱羧反应生成生物胺。组胺是组氨酸脱羧基反应生成的无色无味、不挥发的有机胺，具有毒性，食用组胺含量较高的腌鱼会使人出现急性中毒症状或引起慢性病变，曾出现多起由人食用腌鱼而产生的组胺中毒事故。国际粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)于2012年7月23—27日在罗马召开专家会议，讨论鱼和鱼产品中组胺和其他生物胺引发的公共健康风险问题，确定组胺的无明显损害作用水平值(NOAEL)为50 mg。由于金线鱼腌制品较多，本研究选用金线鱼作为原料进行腌制试验，在不同的时间点取样检测组胺含量。细菌是形成组胺的重要因素，因此在成品腌鱼中分离出产组胺细菌，并对其进行产组胺能力检测和菌属鉴定，以便今后采取有效措施抑制产组胺细菌的生长，控制腌制鱼的组胺含量。

1 材料与方法

1.1 材料

冰鲜金线鱼和食盐均购于湛江市超市。

磷酸组胺标准品(纯度≥99%)、D-组氨酸标准品(纯度≥98%)、L-组氨酸标准品(纯度≥98%)均购于南京奥多福尼生物科技有限公司；其余试剂购于北京陆桥生物技术有限公司。

TD5台式多管架低速离心机，长沙英泰仪器有限公司；G1314F紫外检测器，杭州瑞析科技有限公司；TC-24/H(b)型基因扩增仪，杭州博日科技有限公司；DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；VITEK2Compact微生物全自动分析仪，法国梅里埃公司。

1.2 样品制备

用滤纸吸干金线鱼外表的水，称重，加入30%的食盐，按层鱼层盐的方法将鱼腌制于不锈钢盆中, 室温腌制3 d后置于太阳下晾晒，在第1、2、3、4、5、7、10 d取样检测。

1.3 组胺含量检测

参考《GB 5009.208—2016 食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》方法，用组胺磷酸盐标品配制标准使用液，制作标准曲线。准确称取5 g腌鱼于50 mL离心管中，加入TCA水溶液(100 g·L-1)15 mL，均质1 min， 50 ℃超声波处理30 min，3 000 r·min-1离心10 min后取上清液，水洗沉淀物2次过滤。合并滤液，吸取2 mL滤液置于分液漏斗，加入2～3滴NaOH 溶液(250 g·L-1)使滤液呈碱后，加入3 mL正戊醇，震荡5 min，分别添加正戊醇3次，静置15 min提取上层清液，定容至10 mL。准确吸取2 mL正戊醇萃取液于分液漏斗，添加3 mL盐酸，震荡5 min，连续添加3次盐酸溶液并震荡后静置15 min，收集下层的盐酸萃取液并定容至10 mL，摇匀后以零管为参比，用紫外检测器检测萃取液的吸光度，代入组胺标准曲线方程求出萃取液的组胺含量并计算腌鱼的组胺含量。

1.4 产组胺细菌分离

根据细菌产组胺使培养基碱性增强的原理，利用溴甲酚紫培养基的呈色反应方法进行筛选[1]。由于样品含有多种氨基酸，细菌利用各类氨基酸产生的生物胺都会使培养基碱性增强，必须排除组胺外的其他生物胺的干扰，试验中采用二步筛选法进行产组胺细菌分离。

第一步分离产生物胺的细菌：取25 g腌鱼成品进行碎处理，加入225 mL无菌水，并进行梯度稀释。对最后3个稀释度分别用移液枪移取1 mL稀释液于灭菌平皿，倒入下层培养基(蛋白胨1 g、牛肉膏1 g、酵母膏1 g、葡萄糖0.1 g、琼脂3.6 g、吐温80 0.2 g、磷酸吡哆醛0.01 g、NaCl 0.5 g、MgSO40.08 g、K2HPO40.4 g、D-组氨酸10 g，L-组氨酸1 g、蒸馏水200 mL)10 mL左右轻轻混匀，凝固后于30 ℃培养24～48 h，观察菌落状态并计算菌落总数，然后在表面注入5 mL上层培养基(1.6%溴甲酚紫-乙醇1 mL、琼脂20 g、蒸馏水1 L)覆盖全部菌落，静置5～10 min后观察菌落颜色变化，变紫色或紫蓝色的菌落则为形成生物胺的菌株，不变色或呈其他色泽的菌落则不形成生物胺。第二步筛选产组胺的细菌：用接种环小心挑取产生物胺的菌落接种于D、L-组氨酸琼脂培养基(D-组氨酸10 g，L-组氨酸10 g，NaCl 5 g、磷酸吡哆醛0.01 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L, 调pH 6.0)平板，于30 ℃培养24～48 h至菌落长出充分长成，然后注入上层培养基5 mL左右覆盖菌落，5～10 min变紫或紫蓝色的菌落则为产组胺细菌。

1.5 细菌产组胺能力检测

将分离细菌接种于产组胺能力检测培养基(D/L-组氨酸10 g，大豆蛋白胨17 g，葡萄糖2.5 g，丙酮酸钠10 g，NaCl 3 g，磷酸氢二钾2.5 g，蒸馏水1 L，调pH 6.0)，置于30 ℃恒温培养48 h后按1.3所述的方法检测组胺含量，产组胺含量高的菌株则为产组胺关键细菌。

1.6 产组胺关键细菌的形态学鉴定及生化鉴定

将产组胺关键细菌进行革兰氏染色镜检，并观察细菌菌落特征，同时用全自动细菌鉴定仪作生化反应鉴定。

1.7 产组胺细菌的基因序列鉴定

采用16S rDNA序列鉴定法。参考文献方法[2]，将产组胺细菌制成菌悬液，用细菌通用引物进行PCR扩增，序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司广州分公司完成，将所得序列与NCBI数据库中已知细菌序列进行比对和分析。

2 结果与分析

2.1 金线鱼腌制过程组胺含量

将组胺标准液于波长480 nm处检测吸光值并制作标准曲线，采用Origin8.5对组胺标准曲线进行线性分析，所得标准曲线的拟合方程式为y=0.006x+1.821 8，R2=0.999 4。

组胺含量及细菌总数结果如图1所示，组胺含量与细菌总数的变化规律相似，在腌制第3天出现峰值，第4天开始下降，第7天之后降低至相对稳定状态。这可能是由于原料鱼从冷藏条件到室温条件的变化促使鱼体内细菌快速生长繁殖的缘故。随着腌制时间的延长，食盐的渗透作用使鱼体的盐浓度逐渐增大，水分逐渐流失减少，由此导致部分细菌受到抑制，导致第7～10天细菌总数降至最少。蒋倩倩等[3-4]认为，腌鱼的组胺含量在腌制前期上升，而在腌制后期下降，是由于其他微生物与产组胺细菌存在竞争和拮抗作用，从而使产组胺细菌生长受到抑制，或者部分组胺被降解的缘故。

图1 腌制鱼过程中组胺含量及细菌总数变化

2.2 细菌产组胺能力及关键细菌

筛选细菌得到7株产组胺菌， 产组胺能力如图2所示，其中菌株T4和T6的产组胺量明显大于其余5株细菌，由此确定T4和T6是产组胺关键细菌。

图2 7株细菌培养48 h产组胺量

2.3 产组胺关键细菌的形态学特征与生化特性

细菌自动分析仪分析结果显示，T4与马胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)最接近, 相似度为96%，T6与蜂房芽孢杆菌(Paenibacillusalvei)最接近，相似度为98%。镜检结果显示，T4细胞为圆形，革兰氏阳性，无芽孢，无运动；菌落较小，圆形，边缘整齐，米白色，表面光滑，不透明。T6细胞为杆状, 革兰氏阳性，有芽孢，会运动；菌落较小，圆形，边缘有缺刻，乳白色，表面粗糙无光泽，不透明。形态学检测及生化检测的结果显示，T4、T6分别与蜂房芽孢杆菌和马胃葡萄球菌和蜂房芽孢杆菌高度相似(表1)。

表1 2株产组胺关键细菌部分生化特征

注：-为阴性，+为阳性。

2.4 关键细菌的基因序列鉴定结果

将T4和T6的基因序列提交至NCBI, 提交号为2444712, 将所得基因序列与NCBI数据库的已知细菌序列进行比对，结果T4与马胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)、T6与蜂房芽孢杆菌(Paenibacillusalvei)相似度均达到100%。根据16S rDNA序列检测结果构建T4和T6的基因发育树如图3、4所示。

图3 T4菌株基于16S rDNA基因的系统发育树

3 讨论

在腌制金线鱼过程中，组胺含量呈现近似正态分布的变化规律。腌制初始阶段，组胺含量呈现逐渐上升趋势，腌制第3天左右达到峰值，第4 天出现下降，直至第7～10天组胺含量降低至相对稳定水平。分离细菌的结果显示，细菌总数的变化也与组胺变化规律相似，其中产组胺细菌有7株，产组胺能力相参较强的细菌是马胃葡萄球菌和蜂房芽孢杆菌。

杨健[5]在鲐鱼产组胺微生物生物学特性研究中表明,低温可以抑制产组胺细菌的生长并能抑制其产生组胺，与本研究结果一致。吴素娟等[6]人认为，随着干制时间的推移，鱼肉水分含量和水分活度不断降低，到腌制后期，水分活度限制了产组胺细菌的生长，导致组胺含量逐渐降低，这与本实验在第4～10天的干制阶段发现组胺含量下降的结果类似。另外，曾令彬等[7]发现，腌鱼中主要的微生物群是微球菌、葡萄球菌、乳酸菌和酵母菌等，部分微生物除了产组胺外，还会产生其他生物胺或其他呈味物质[8]，由此产生腌鱼理化性质和质构的变化。陈玉峰等[9]建议在生产过程中采用低温干燥的办法抑制脱羧酶活性和产组胺细菌的生长，从而有效控制腌制鱼中组胺的生成。基于这些研究报道，结合本研究结果，为了健康和安全地食用腌制鱼，尽量选择盐渍后干制至第7天之后的腌鱼进行食用，或者采取特定的技术方法抑制产组胺关键细菌，降低腌制鱼中组胺的生成量。

图4 T6菌株基于16S rDNA基因的系统发育树