梁小辉，孟战备，郑红玲

（洛阳市妇女儿童医疗保健中心，河南 洛阳 471000）

哮喘是一种以气流阻塞为特征的复杂性临床综合征，与气道高反应性（airway hyperresponsiveness,AHR）和细胞炎症有关[1-2]。血清标志物在哮喘的诊断中具有重要的意义，并可鉴定哮喘表型。WoodruffPG等[3]利用骨膜蛋白作为Th2诱导气道炎症的生物标志物，对气道上皮细胞的基因表达谱进行研究，结果显示白细胞介素-13的响应基因POSTN（该基因可以编码骨膜蛋白）的表达水平可将哮喘患者分为高Th2表型和低Th2表型，前者对吸入性皮质激素（ICS）反应良好，但后者不敏感。另有研究显示白细胞介素-13单克隆抗体可改善肺功能，尤其是对血清骨膜蛋白水平很高的患者[4]。生物标志物分析表明，奥马珠单抗可显著降低高骨膜蛋白水平哮喘患者的发作频率，其机制与呼出气一氧化氮（FENO）分数及血液中嗜酸性粒细胞水平相关[5]。因此，血清中骨膜蛋白是Th2诱导气道炎症、嗜酸性气道早期炎症和Th2靶向治疗反应的最理想生物标志物[6]。气道对外源性刺激的AHR是哮喘的重要特征[7]，既往研究表明Th2型细胞因子白细胞介素-13可刺激肺成纤维细胞和气道上皮细胞产生骨膜蛋白[3]。尽管具体作用机制尚无完全阐明，本文推测哮喘患者中，骨膜蛋白涉及哮喘气道炎症和气道高反应性机制的调控。本研究探讨哮喘儿童骨膜蛋白与AHR的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年12月—2016年6月本中心收治的哮喘儿童60例为哮喘组，根据《全球哮喘倡议》指南[8]，其中轻度间歇性哮喘16例，轻度持续性哮喘21例，中度哮喘23例。另外选择健康儿童30例为对照组。纳入标准：符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[9]中儿童支气管哮喘诊断标准。排除标准：在过去6个月中出现哮喘急性发作且需全身糖皮质激素控制者，在研究前4周胸片显示有明显的肺部疾病者。本研究经伦理委员会批准通过，研究对象及监护人均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 研究设计本研究分为4个阶段：①准备阶段，试验期间所有患者均要求停止使用控制药物；②第1次随访，采集两组血液标本，并测量呼出一氧化氮水平，进行皮肤点刺试验和肺、支气管的呼吸量测定；③第2次随访，对患者进行乙酰甲胆碱和吸入甘露醇支气管激发试验；④第3次随访，内容同第2次随访。两次随访之间间隔至少1周。血清中骨膜蛋白水平测定之前，血标本-80℃保存。

1.2.2 甘露醇支气管激发试验记录两组吸入甘露醇干粉的一秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second，FEV1），作为基线值。当出现基线状态下FEV1变化值≥15%时，被认为结果阳性，即完成了甘露醇支气管激发试验，或者当出现最大累积剂量甘露醇（635 mg）也被认为完成了甘露醇支气管激发试验，其余为阴性结果。针对甘露醇支气管激发试验阳性试验结果，引起FEV1变化值≥15%的累计激发剂量（PD15剂量水平）是通过最后两个数据点的对数线性插值计算出来的。甘露醇相应的数值即PD15值。

1.2.3 乙酰甲胆碱激发试验受试者以日本产Chest Hl-501型肺功能仪测FEV13 次（相差＜5%），取平均值作为基线。取坐位、夹鼻，以Wright雾化器[美国产DEVILBISSAP-50空气压缩机驱动，雾化量恒定在（0.13±0.02）mL/min，雾化颗粒直径1.0～ 3.0 μ]，潮气呼吸法吸入生理盐水2 min后测FEV13次并与基础值比较降低均不到10%，然后从低浓度开始顺次吸入各浓度的乙酰甲胆碱溶液(浓度为0.03～128 mg/mL,成倍递增)，每一浓度吸入2分钟，于吸入后第30 s、90 s各测FEV1，间隔5 min吸下一浓度，直至FEV1下降20%以上或最高浓度为止。以引起FEV1下降20%的乙酰甲胆碱浓度表示气道反应性（即PC20值）的高低。

1.2.4 呼出一氧化氮水平测定采用便携式一氧化氮分析仪测量呼出一氧化氮，该分析仪可以提供以每十亿分之一为度量单位的50 mL/s呼气流速的测量。根据美国胸科协会的指导方针，用该装置测定的结果在临床上可接受，与固定分析仪提供的测量结果一致。

1.2.5 血清生物标志物的测量两组采集空腹肘静脉血5 mL，采用酶联免疫吸附试验测量骨膜蛋白水平。

1.3 观察指标

观察并记录两组一般资料、外周血标志物水平，包括骨膜蛋白、总免疫球蛋白（Ig）E水平、嗜酸性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白和呼出一氧化氮；采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）评价血清骨膜蛋白水平的诊断价值。

1.4 统计学分析

应用SPSS 21.0软件分析数据，正态分布的计量资料以“±s”表示，采用t检验；非正态分布的计量资料以中位数（四分位间距）[M（Q1，Q3）]表示，采用秩和检验；计数资料以百分数（%）表示，采用χ2检验；相关性分析采用Spearman法；应用ROC曲线分析血浆骨膜蛋白诊断哮喘的效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组年龄、性别、体质量指数（BMI）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）等资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。60名哮喘儿童中，乙酰甲胆碱支气管激发试验（BPT）结果全部为阳性，甘露醇支气管激发试验阳性40例，阴性20例。哮喘组FEV1、FEV1/FVC显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；哮喘组使用支气管扩张剂FEV1变化量大于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 两组血清标志物比较

哮喘组骨膜蛋白、总IgE水平、嗜酸性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白水平和呼出一氧化氮值高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 血清骨膜蛋白水平诊断哮喘的ROC曲线

ROC曲线结果显示，当血清骨膜蛋白为90 ng/mL作为最佳截断值，其诊断哮喘的AUC为0.65（95CI：0.50～0.75，P＜0.05），灵敏度为30%，特异度为95%，阳性预测值为49%，阴性预测值91%。见图1。

2.4 检测指标与骨膜蛋白水平的相关性分析

Spearman秩相关结果显示，血清骨膜蛋白水平与嗜酸性粒细胞计数、呼出一氧化氮水平呈正相关（r=0.332，P=0.017；r=0.383，P=0.002），与总 IgE 水平、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白水平、FVC1、FEV1/FVC等无线性相关（P＞0.05）。见表3。

2.5 乙酰甲胆碱和甘露醇激发试验检测骨膜蛋白与AHR的相关性

哮喘组血清骨膜蛋白水平与乙酰甲胆碱PC20值和甘露醇PD15值呈负相关（r=-0.293，P=0.038；r=-0.463，P=0.003）。调整了年龄、性别、遗传性过敏症、Log骨膜蛋白水平之后，血清骨膜蛋白水平的对数值与乙酰甲胆碱PC20对数值（生物标志物水平增加2倍，乙酰甲胆碱PC20对数值下降1.229%）、甘露醇PD15对数值（生物标志物水平增加2倍，甘露醇PD15对数值下降1.661%）显著相关（P＜0.05）。见表4。

图1 血清骨膜蛋白水平诊断哮喘的ROC曲线

表1 两组一般资料比较

表2 两组血清标志物比较

表3 检测指标与骨膜蛋白水平的相关性分析

表4 多元线性回归分析乙酰甲胆碱和甘露醇激发试验检测骨膜蛋白与AHR的相关性

3 讨论

骨膜蛋白是一种分泌蛋白，在结缔组织、骨、心肌、心瓣膜和皮肤中均可表达[10-11]。研究认为骨膜蛋白通过与多种整合素相互作用，可参与细胞增殖和再生、上皮-间质转化、纤维化和血管生成[12-13]。传统上认为哮喘是由于吸入性过敏原引起的Th2炎症反应所致，通常是以气道嗜酸性粒细胞浸润为常见特征[14]。导致气道炎症细胞持续存在、气道结构的改变、平滑肌功能的改变、哮喘患者AHR的机制尚不清晰。可通过采用直接刺激（如乙酰甲胆碱）或间接刺激（包括锻炼、高渗盐水及甘露醇）来进行支气管激发试验，进而评估气道对外源性刺激的AHR。骨膜是哮喘气道新发现的一种成分的加厚基底膜，与哮喘纤维化有关，是气道重塑的一个特征[15-17]。

本研究结果显示，与健康儿童比较，哮喘儿童血清骨膜蛋白水平显著升高，与文献[3,18,19]研究结论一致。本研究中血清中骨膜蛋白水平与外周细胞嗜酸性粒细胞计数、呼出一氧化氮量显著正相关，与文献[20]报道相符。用乙酰甲胆碱导致支气管收缩和甘露醇所致的特征不同，甘露醇试验通过1个或多个中间机制触发气道平滑肌收缩，如介质，包括白三烯，前列腺素，组胺和炎性细胞，引起气道炎症；而乙酰胆碱直接作用于呼吸道平滑肌受体，不会引起炎症的触发收缩[21]。与乙酰胆碱试验相比，甘露醇试验用来识别当前哮喘症状时，特异度更高，此外，甘露醇数据与气道炎症程度和疾病严重程度有较好的相关性[22-23]。本研究结果显示，血清骨膜蛋白水平的对数值与乙酰甲胆碱PC20对数值（生物标志物水平增加2倍，乙酰甲胆碱PC20对数值下降1.229%）、甘露醇PD15对数值（生物标志物水平增加2倍，甘露醇PD15对数值下降1.661%）显著相关。该试验结果测量使用乙酰甲胆碱和甘露醇所致AHR。

总之，哮喘儿童血清中骨膜蛋白水平与甘露醇试验和乙酰甲胆碱试验引发的AHR相关，外周血细胞中骨膜蛋白水平有望作为具有临床应用的生物标志物。然而，本研究存在以下局限性：样本量小；无法讨论研究结果与哮喘控制不佳的关系；尽管本研究结果显示哮喘患者群体和健康群体之间骨膜蛋白水平差异显著，但骨膜蛋白水平的ROC曲线AUC仅为0.65。骨膜蛋白与其它生物标志物联合使用可能更有效，因此，有必要进行大型随机临床试验证实。