高鹏辛嘉英张兰威

（1.哈尔滨商业大学 黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076；2.哈尔滨工业大学化工学院，黑龙江哈尔滨150076；3.中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃兰州730000）

玉米淀粉作为制备可生物降解材料的原料对环境污染治理和石油危机都有重要意义。但由于其分子间和分子内部多羟基的相互作用，以及其具有一定规整的结晶性，玉米原淀粉受热时，分解温度低于熔融温度，导致其成膜性较差。经酯化后的淀粉不仅降低了老化回生、糊凝胶化、脱水缩合现象，也改变了淀粉糊透明度、光泽度、黏度特性、凝胶质构、成膜性、热稳定性、乳化及乳化稳定性，广泛应用在食品、药品、纺织、造纸等行业。此外，酯化淀粉在表面包装材料和可生物降解材料上有潜在的应用前景[1-2]。阿魏酸淀粉酯是一种新型的阿魏酸糖基衍生物，具有抗氧化、抗菌、抗炎症、抗血栓、抗癌、治疗冠状动脉疾病，降低胆固醇和增加精子活力等功效[3-4]。而且，阿魏酸淀粉酯具有较强的抗α-淀粉酶水解能力，可以减少其在肠胃中被淀粉酶水解的机会，增加进入大肠的可能性。阿魏酸淀粉酯进入结肠后，淀粉会被结肠中的微生物完全发酵降解，将阿魏酸释放出来，更好地发挥其抗结肠癌的作用。因此，淀粉可以作为阿魏酸的合适载体，将阿魏酸带入肝肠循环并完全释放，作为阿魏酸的潜在供体[5-7]。阿魏酸淀粉酯的合成解决了阿魏酸，无法进入结肠发挥作用的难题。目前，对于阿魏酸淀粉酯的合成研究很少，蓝志东等于2001年报道采用化学法合成了阿魏酸淀粉酯[8]，本课题组初步研究了在非水相体系中用脂肪酶作为催化剂催化阿魏酸淀粉酯的合成[9]。用生物法合成阿魏酸淀粉酯相对于化学法来说更安全，适合应用于食品、化妆品、医药以及精细石油化工等行业，扩大了其应用范围，强化了淀粉酯化改造阿魏酸的现实意义。但利用脂肪酶催化合成阿魏酸淀粉酯存在一个瓶颈问题，由于阿魏酸和淀粉均不是脂肪酶的天然底物，导致酶促反应不易发生，产物取代度低，脂肪酶的催化反应活性受到抑制。曾拟采用微波辅助法解决此问题，但由于微波作用时间过长会使脂肪酶失活，效果并不明显。

纳米金由于具有很好的生物亲和性和良好的纳米材料特性，其作为生物催化剂备受青睐。一些研究已经证明，纳米金可以作为生物催化剂催化酯化反应和氧化还原反应[10]。在反胶束体系内，纳米金粒径及用量是影响其催化活性的主要因素[11]。为了解决脂肪酶催化阿魏酸淀粉酯合成的瓶颈问题，本研究拟向反应体系中加入纳米金，欲借助纳米金的热点效应及微波传导效应提高酶促反应活性。此研究也为功能性改性淀粉的生物制备提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

预处理玉米淀粉：黑龙江省高校重点实验室自制；阿魏酸乙酯（＞97%）、氯金酸（＞99.9%）：上海同田生物科技有限公司；Novozyme 435固定化南极假丝酵母脂肪酶（10 000 U/g）：丹麦诺维信公司；柠檬酸钠及其他常用试剂均为国产分析纯。

UV2550型紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；XH-100A微波反应器：北京祥鹄科技发展公司。

1.2 试验方法

1.2.1 纳米金的制备

取100 mL 0.01%氯金酸溶液置于平底烧瓶中，加热至沸腾，在氯金酸溶液保持沸腾的状态下加入1%柠檬酸钠溶液2 mL，持续加热，当溶液颜色变为酒红色时停止加热。冷却，4℃低温保存。

1.2.2 脂肪酶催化阿魏酸淀粉酯的合成

1）常规加热法：所有试剂使用之前进行分子筛脱水预平衡，将一定量阿魏酸乙酯加入到50 mL三角瓶中，加入10 mL异辛烷，底物溶解后加入一定量预处理淀粉（淀粉与阿魏酸乙酯的摩尔比为1∶3）在磁力搅拌的作用下混溶，加入一定量纳米金和淀粉质量分数10%的Novozym435脂肪酶磁力搅拌作用下混匀后在油浴中开始反应，反应温度65℃，反应时间为18 h。反应完成后，用无水乙醇洗涤产物直至滤液中无剩余阿魏酸乙酯，洗涤后产物放于70℃鼓风干燥箱中干燥，研磨、过筛并保存。

2）微波辅助法：反应体系与常规加热法一致，当体系构建好之后将反应体系在3 000 r/min的转速下充分搅拌1 min，使得各组分混合均匀再置于微波反应器中进行反应，XH-100A微波反应器可以实现恒温条件下，微波功率的持续输出。

1.2.3 产物取代度的测定

采用UV2550型紫外-可见分光光度计对产物取代度进行测定，将产物的碱水解液用氯仿萃取，测得水解后阿魏酸的吸光值，经回归方程计算其含量，从而得到取代度[12]。

1.2.4 标准曲线的测定

准确称取一定量的阿魏酸定容于定量体积的氯仿中，配制得到质量浓度为 0、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 g/L的阿魏酸标准溶液，在320 nm左右波长下测得不同浓度溶液的吸光值，以溶液质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.5 阿魏酸淀粉酯水解

称取0.10 g产物于50 mL三角瓶中，加入30 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠溶液，50℃下搅拌水解3 h。用0.1 mol/L的盐酸滴定调节pH≈2，静置一段时间移取上清水解液20 mL于分液漏斗中，用氯仿萃取收集萃取液定容至100 mL[13]。

1.2.6 取代度（DS）计算

将产物萃取液置于UV2550紫外-可见分光光度计在320 nm下测定吸光值，根据标准曲线得到产物中阿魏酸含量，并按下式计算取代度[9]：

式中：W为阿魏酸在阿魏酸淀粉酯中的质量分数，%；C为根据阿魏酸标准曲线计算得到的阿魏酸质量浓度，mg/L；V 为萃取液体积，mL；m0为产物质量，g；M为阿魏酸相对分子质量，194.19。

1.2.7 产物定性分析

1.2.7.1 紫外光谱分析

采用UV2550紫外-可见分光光度计进行全波长扫描，扫描条件：双光束，扫描范围800 nm～200 nm，狭缝宽度1.0 nm。

1.2.7.2 核磁共振氢谱分析

将样品溶于二甲基亚砜进行核磁共振氢谱测试。观察频率：400 MHz，谱宽（δ）：0～15，探头：5 mm，脉冲序列：30，测定温度：25℃。

1.2.8 纳米金的透射电镜分析

反应体系中的纳米金在进行透射电镜分析前，需将反应体系混合物用乙醇沉出烘干制成粉末，该粉末用蒸馏水在超声波辅助条件下复溶10 min后送检，进行常规透射电镜检测。

2 结果与讨论

2.1 纳米金对酶促反应的影响

纳米金对酶促反应的影响，与加热方式有关。图1为常规加热与微波辐射加热条件下，不同催化剂催化阿魏酸淀粉酯合成的结果图。

图1 常规加热和微波辐射条件下纳米金对酶促反应的影响Fig.1 The effect of AuNPs on the enzymatic reaction under the conventional heating and microwave

如图1所示，当采用常规加热法进行阿魏酸淀粉酯合成时，纳米金的加入并没有明显提高酶促反应活性。而在该反应体系中，纳米金也具有一定的催化反应活性，此时取代度的增加基本为纳米金的催化作用与脂肪酶催化作用的叠加。当采用微波辅助法进行阿魏酸淀粉酯合成时，若纳米金和脂肪酶单独使用，纳米金的催化反应活性明显提高，而脂肪酶的催化反应活性的提高并不显著；而当二者同时使用时，取代度的增加会表现出耦合效应。这可能是由于微波辐射具有选择性吸收的特点[14]，当体系中有纳米金存在时，纳米金可以完全吸收体系中的微波辐射能，产生的热点效应使其周围的底物被活化的同时，避免脂肪酶吸收微波瞬间高热而失活。

纳米金在加入反应体系前后的分布状态，通过透射电镜观察结果见图2。

如图2所示，由于淀粉具有防止纳米金团聚的作用，因此纳米金在反应体系中仍然保持均匀分散状态，并且粒径适当时部分纳米金会进入到淀粉结构中，此时纳米金作为微波辐射能的载体，借助其产生的热点效应及催化作用使得阿魏酸淀粉酯的取代度大大提高。

图2 纳米金加入反应体系前后透射电镜图Fig.2 The transmission electron microscopy（TEM）of AuNPs

2.2 纳米金粒径对酶促反应的影响

在微波辅助催化阿魏酸淀粉酯合成的反应系统中，纳米金的加入会提高阿魏酸淀粉酯的取代度，但纳米金的粒径对其会产生一定的影响，如图3所示。

从图3结果可以看出，当纳米金粒径大约小于150 nm的范围内，纳米金粒径为40 nm时阿魏酸淀粉酯的取代度最大。之后随着纳米金粒径的变大，阿魏酸淀粉酯的取代度基本保持不变，当纳米金粒径大约在大于500 nm之后又会有一个相对明显的升高。这一现象与纳米金的本身特点有关，若纳米金作为催化剂其粒径越小催化活性越大[14-15]，而对于其产生的热点效应，则是在一定范围内，粒径越大热点效应越显著。基于此分析本试验的结果，说明该反应主要受益于纳米金在微波辐射下产生的热点效应。

2.3 纳米金用量对酶促反应的影响

在微波辅助酶促阿魏酸淀粉酯的合成体系中，不仅纳米金的粒径会对反应产生影响，纳米金的用量也会对阿魏酸淀粉酯的合成产生明显影响，如图4所示。在研究过程中，纳米金是以溶液的形式加入，所以纳米金的用量不宜过多。

图3 纳米金粒径对酶促反应的影响Fig.3 Effect of the size of AuNPs on the enzymatic reaction under microwave

图4 纳米金用量对酶促反应的影响Fig.4 Effect of the amount of AuNPs on the enzymatic reaction under microwave

图4结果表明，起初阿魏酸淀粉酯的取代度会随着纳米金用量的增加而提高，但当纳米金的加入量超过0.8%后，阿魏酸淀粉酯的取代度开始下降。这主要是由于，纳米金加入的同时会改变体系的含水量，因为该反应为转酯化反应，过多的水会使反应朝着水解的方向进行。并且，该研究所用的纳米金是通过柠檬酸钠法合成的，大量Na+的存在，也会影响酶的活性。但由于该反应是非均相体系反应，适当的水分含量会提高固相淀粉颗粒的分散均匀性，降低体系黏度，且避免了反应后期因异辛烷挥发造成底物及产物挂壁不易回收等问题。并且与最大取代度相比，当纳米金用量为0.8%时，阿魏酸淀粉酯的取代度仅下降了5.5%并不明显。综合考虑，最佳纳米金用量为0.8%。

2.4 微波功率对酶促反应的影响

纳米金辅助微波耦合酶促阿魏酸淀粉酯合成的反应中，在低功率微波辐射条件下，阿魏酸淀粉酯的取代度最大。这一结果与一致认为的低功率微波有利于酶促反应进行是一致的。微波功率对酶促反应的影响见图5。

图5 微波功率对酶促反应的影响Fig.5 Effect of microwave power on the enzymatic reaction

当微波功率为80 W时，阿魏酸淀粉酯的取代度最大为0.178 9。而当微波功率升高至320 W时，取代度下降至0.012。然而，对于纳米金的热点效应来说，通常微波功率越大，纳米金产生的热点效应越显著，但图4结果却与这一理论相悖[14-15]。综合前面结果说明，在整个反应过程中微波辐射和脂肪酶产生的耦合效应是在纳米金的保护作用下实现的。因此，在有纳米金存在的条件下，微波功率也不宜过高，高功率产生的热点效应较为强烈，同样会使脂肪酶失活。故最佳功率为80 W。

2.5 微波时间对酶促反应的影响

纳米金的加入可以适当延长酶促反应时间，如图6所示。在纳米金的保护作用下，脂肪酶不会因为微波辐射作用而迅速失活。

图6 微波时间对酶促反应的影响Fig.6 Effect of time on the enzymatic reaction

当在反应体系中加入纳米金，反应180 min后，阿魏酸淀粉酯的取代度仍然可以达到0.14左右，最佳反应时间为120 min，取代度为0.178 9。而不加纳米金时，反应到120 min以后基本就不再发生，最佳反应时间为60 min，取代度为0.015 6。并且在反应前30 min无论是否加入纳米金，阿魏酸淀粉酯的取代度随反应时间的延长，增加程度基本一致。由此进一步证明，纳米金的加入对脂肪酶具有保护作用，使其催化活性不易被破坏，从而使得微波辐射与脂肪酶之间的耦合作用得以实现并持续进行。而微波辐射与脂肪酶之间的耦合效应是在反应进行30 min以后开始发生。

2.6 阿魏酸淀粉酯的定性分析

用无水乙醇反复洗涤产物至无阿魏酸乙酯及阿魏酸（避免副反应阿魏酸乙酯水解产物，通过薄层层析分析基本无阿魏酸[9]）检出后，对产物进行碱液水解、氯仿萃取，萃取液进行紫外吸收光谱全波长扫描分析。分析结果见图7。

图7 产物阿魏酸淀粉酯水解后紫外色谱全波长扫描分析图Fig.7 UV-vis absorption spectrum of hydrolysate of starch ferulate

由图7可以看出，在波长315 nm左右出现特征吸收峰，而阿魏酸标准品的紫外吸收峰也在315 nm附近，这一结果初步证实阿魏酸淀粉酯成功合成。为进一步排除阿魏酸乙酯残留的干扰，充分证实产物的合成，对纯化后的产物进行1H NMR谱图分析，如图8所示。图中横坐标为在磁场作用下不同化学基团上氢核共振产生的化学位移值。通过图中各共振峰出现的信号位移值判断此化合物中有哪些化学基团。

由图 8（a）、图 8（b）、图 8（c）可知 δ3.07～δ3.59 以及δ4.56～δ5.47产生的共振峰为淀粉分子中氢核的共振峰；δ4.15以及δ6.44～δ7.56产生的共振峰为阿魏酸乙酯上氢核的共振峰。而对比阿魏酸乙酯和产物阿魏酸淀粉酯的1H NMR谱图，阿魏酸乙酯在δ9.60出现的特征共振峰，而产物在此位置并未出现，这一结果说明产物谱图中出现的阿魏酸乙酯的相关振动峰并非阿魏酸乙酯残留所导致，而是阿魏酸侧链成功接到淀粉链上。这也证明用乙醇反复洗涤可以彻底去除未反应的阿魏酸乙酯。结合紫外光谱分析，证明了阿魏酸淀粉酯的合成。

图8 1H NMR分析谱图Fig.8 1H NMR spectrum

3 结论

在微波辅助酶促阿魏酸淀粉酯合成反应体系中加入适量的纳米金可以明显地提高阿魏酸淀粉酯的取代度。通过紫外光谱结合1H NMR谱图分析，证明阿魏酸淀粉酯的合成。当纳米金粒径为700 nm，添加量为0.8%，微波功率为80 W，反应时间为120 min的条件下，阿魏酸淀粉酯的取代度最大为0.179 8，较现有研究提高一个数量级。这一结果，表明在微波耦合脂肪酶催化反应体系中加入纳米金可以有效提高酶促反应活性，增加阿魏酸淀粉酯的取代度。透射电镜分析结果显示部分纳米金会插入到淀粉的分子结构中，并且在淀粉的保护作用下纳米金仍然保持均匀分布状态，结合试验现象可以判定，在该反应体系中纳米金的促进作用，主要是通过其吸收微波后产生的热点效应，以及对脂肪酶的保护作用来实现，进而使微波辐射与脂肪酶能够产生耦合效应。