杨海玲，赖少凤，农海妮，刘彦婷，胡昌江

（1.成都中医药大学，四川成都610072；2.广西中医药大学，广西南宁530001）

广山楂为蔷薇科苹果属植物台湾林檎Malusdoumeri（Bois.）Chev.或光萼林檎 Malusleiocalyca S.Z.Hunag的干燥成熟果实，其性味酸、甘、涩，微温，归脾、胃、肝经，具有消食健胃，行气散瘀的功效，可用于肉食积滞，胃脘胀满，泻痢腹痛，瘀血经闭，产后瘀阻，心腹刺痛，疝气疼痛，高脂血症等。广山楂在广西地区作为临床常用药物，已有90多年历史，有生用、炒黄、炒焦、炒炭、酒炙、盐炙等多种炮制方法[1]。广山楂中含有黄酮、有机酸、萜类、甾醇类等多种成分[2-3]。现代药理研究表明，儿茶素具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等作用[4-8]，柚皮苷则具有促进骨细胞增殖和分化成熟[9-10]、抑制骨关节炎软骨细胞凋亡作用[11]等多方面生物活性。根皮苷具有抗癌、抗病毒、抗氧化等作用[12-15]。近年来，有学者比较了不同产地的广山楂中芦丁[16]、金丝桃苷含量[17]，但对于广山楂及其不同炮制品中儿茶素、柚皮苷、根皮苷等3种活性成分含量的研究，鲜见有文献报道。基于此种情况，本研究拟对广山楂中上述3种主要化学成分含量进行研究，为探讨广山楂及其炮制方法的科学性及临床合理使用提供科学参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-1260AT高效液相色谱分析仪（G1315D DAD检测器，G1311C四元泵，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，Agilent ChemStation色谱工作站）：美国安捷伦公司；SHIMADZU VP-ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：岛津-GL（上海）商贸有限公司；SQP 型电子分析天平：德国赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2 药材

广山楂采集于桂林市平乐县，经广西中医药大学梁子宁副教授鉴定，为蔷薇科苹果属植物台湾林檎Malusdoumeri（Bois.）Chev.的干燥成熟果实。

1.3 试剂

儿茶素、柚皮苷、根皮苷对照品（纯度质量分数＞98%）：成都艾特姆生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯）：赛默飞世尔（中国）有限公司；实验用纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 试验方法

2.1 广山楂不同炮制品制备

生品：取广山楂饮片，放入40℃的烘箱中烘10 h，取出放凉，即得。

炒黄品：取净广山楂饮片100 g，置预热的电炒锅内，中火（1 500 W）加热，连续加热5 min，炒至表面浅黄色，取出，晾凉，称重，即得，收率为94.29%（收率/%=炮制后合格品质量（g）/生品质量（g）×100）。

炒焦品：取净广山楂饮片100 g，置预热的电炒锅内，中火（1 500 W）加热，连续加热6 min，炒至表面焦黄色，略见焦斑，取出，晾凉，称重，即得，收率为92.86%（收率/%=炮制后合格品质量（g）/生品质量（g）×100）。

炒炭品：取净广山楂饮片100 g，置预热的电炒锅内，武火（2 100 W）加热，连续加热9 min，炒至表面焦黑色，内部焦褐色，取出，晾凉，称重，即得，收率为75%（收率/%=炮制后合格品质量（g）/生品质量（g）×100）。

酒炙品：取净广山楂饮片100 g，加入黄酒20 g（加适量水稀释），闷润，待溶液吸尽后，置预热的电炒锅内，武火（600 W）加热，连续加热10 min，炒至表面近干，取出，晾凉，称重，即得，收率为95.20%（收率/%=炮制后合格品质量（g）/生品质量（g）×100）。

盐炙品：取净广山楂饮片100 g，加入食盐2 g，加适量水稀释，闷润，待溶液吸尽后，置预热的电炒锅内，武火（600 W）加热，连续加热10 min，炒至表面近干，取出，晾凉，称重，即得，收率为98.7%（收率/%=炮制后合格品质量（g）/生品质量（g）×100）。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取儿茶素对照品242.0 mg、柚皮苷对照品8.0 mg、根皮苷对照品13.3 mg，置于同一50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度。精密量取上述对照品溶液 0.5、1.5、2.5、5、7.5、10 mL 至量瓶中，加甲醇定容至10 mL，即得。

2.3 供试品溶液的制备

分别精密称取各样品粉末（65目）1.0 g，精密加入甲醇20 mL，称重，回流提取2 h，放冷，补足重量，过滤，取滤液适量，离心冷藏备用。

2.4 色谱条件

色谱柱 SHIMADZU，VP-ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序（0～5 min，6%～6%B，5.1 min～15 min，6%～10%B；15.1 min～27 min，10%～17%B；27.1 min～50 min，17%～38%B ；50.1 min～60 min，38%～52%B）；流速0.8 mL/min；紫外检测波长为 285 nm；柱温30 ℃；进样量 10 μL。

2.5 线性关系的考察

分别精密吸取儿茶素、柚皮苷、根皮苷混合对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，依法测定，以对照品的进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，即得。

2.6 精密度试验

精密吸取“2.2”对照品溶液 10 μL，在“2.4”项色谱条件下，连续进样6次，计算各峰峰面积RSD。

2.7 重复性试验

精密称取同一样品（生品）粉末（65目）1.0 g，平行6份，按“2.3”项下的制备方法制备溶液，依法测定，即得。

2.8 稳定性试验

精密吸取广山楂（生品）溶液 10 μL，分别在 0、1、4、8、12、24 h进样，分别考察3种成分的稳定性，即得。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量样品（生品）粉末6份，每份约0.5 g，精密称定。采用加样回收试验，分别精密加入适量儿茶素、柚皮苷、根皮苷对照品，精密称定。依“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下条件测定，即得。

2.10 样品含量测定

取各炮制品粉末（65目）各1.0 g，平行3份，按“2.3”项下制备各供试品溶液，分别吸取各样品10 μL，依法进样进行测定，计算各自样品含量。

3 结果与分析

3.1 线性关系的考察

按照“2.5”项下方法，进行线性关系考察，结果见表1。结果表明，各成分在各自浓度范围内呈良好线性关系。

表1 广山楂中3种有效成分线性关系考察Table 1 Investigation of linear relation of three ingredients in Malusdoumeri（Bois.）Chev

3.2 精密度试验

按照“2.6”项下方法进行的精密度试验，结果见表2。

表2 精密度试验结果（n=6）Table 2 The results of accuracy test（n=6）

结果儿茶素、柚皮苷、根皮苷峰面积的RSD分别为1.33%、1.65%、2.81%，表明该方法测定结果的仪器精密度良好。

3.3 重复性试验

重复性试验结果见表3。

结果儿茶素含量为3.70 mg/g，RSD为0.95%；柚皮苷含量为2.54 mg/g，RSD为2.35%；根皮苷含量0.37 mg/g，RSD为0.88%，结果表明本研究建立方法重复性良好。

表3 重复性试验结果（n=6）Table 3 The results of repetitive testing（n=6）

3.4 稳定性试验

稳定性试验结果见表4。

结果儿茶素、柚皮苷、根皮苷峰面积RSD分别为1.34%、1.68%、2.56%，试验结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.5 加样回收率试验

加样回收试验结果见表5。

表4 稳定性试验结果（n=6）Table 4 The results of stability test（n=6）

表5 儿茶素、柚皮苷、根皮苷的加样回收率试验（n=6）Table 5 The sample recovery experiment of catechin，naringin and phlorizin（n=6）

结果如表5所示，结果儿茶素、柚皮苷、根皮苷的平均回收率分别是100.34%、100.19%、99.89%；RSD依次为0.85%、1.04%、1.61%。

3.6 样品含量测定

广山楂不同炮制品儿茶素、柚皮苷、根皮苷的含量测定结果见表6。

由表6可以看出各炮制品中儿茶素含量如下：炒焦品（14.23 mg/g）＞盐炙品（12.53 mg/g）＞炒黄品（7.35 mg/g）＞炒炭品（7.23 mg/g）＞酒炙品（5.12 mg/g）＞生品（3.71 mg/g）；柚皮苷含量为：酒炙品（6.18 mg/g）＞炒焦品（5.35 mg/g）＞盐炙品（4.66 mg/g）＞炒黄品（3.26 mg/g）＞生品（2.54mg/g）＞炒炭品（1.87mg/g）。根皮苷含量依次是：盐炙品（0.98 mg/g）＞炒焦品（0.82 mg/g）＞酒炙品（0.76 mg/g）＞炒黄品（0.43 mg/g）＞生品（0.37 mg/g）＞炒炭品（0.27 mg/g）。广山楂不同炮制品HPLC色谱图见图1。

图1 广山楂不同炮制品HPLC色谱图Fig.1The HPLC of Malusdoumeri（Bois.）Chev before and after being processed

由图1可以看出，在广山楂各不同炮制品在色谱图相应的位置均能检测到儿茶素、柚皮苷和根皮苷的对照品色谱峰，结果表明广山楂的不同炮制品中均含有上述3种活性成分，且得到了较好的分离，相邻峰间分离度均大于1.5。

4 结论

广山楂是一种以果实为入药部位，也是一种药食两用的药材，在广西地区作山楂使用已有近百年历史。目前，在现行的广西壮族自治区中药饮片炮制规范（2007）中收载了炒黄、炒焦、炒炭等多种炮制方法[1]，但尚未建立广山楂饮片指标性成分含量测定方法与标准，对其饮片质量控制将产生不利影响。因此本研究首次采用HPLC比较了广山楂及其不同炮制品中儿茶素、柚皮苷、根皮苷3种成分含量。由表6可看出，各炮制品中儿茶素含量高低顺序为：各炮制品中儿茶素含量如下：炒焦品（14.23 mg/g）＞盐炙品（12.53 mg/g）＞炒黄品（7.35 mg/g）＞炒炭品（7.23 mg/g）＞酒炙品（5.12 mg/g）＞生品（3.71 mg/g）；进一步分析广山楂不同炮制品中儿茶素含量，发现不同炮制品中尤以炒焦和盐炙法炮制后含量为高，分别约为生品的3.8倍和3.4倍；炒黄品、炒炭品、酒炙品含量分别为生品1.98、1.94、138倍。该结果说明，炮制可提高儿茶素含量。这可能与糖类成分在加热的条件，转化形成儿茶素有关，其转化机理有待进一步研究。柚皮苷含量为酒炙品＞炒焦品＞盐炙品＞炒黄品＞生品＞炒炭品。根皮苷含量则为盐炙品＞炒焦品＞酒炙品＞炒黄品＞生品＞炒炭品。经对比分析发现，酒炙、盐炙、炒焦、炒黄的炮制方法均提高柚皮苷、根皮苷含量，生品次之，分析原因，可能与柚皮苷和根皮苷同属于黄酮苷类物质，药物中存在的相应水解酶使部分苷类成分发生水解，从而使生品含量较低。而炒炭法炮制后样品含量最低，这可能与其炒炭时温度高、时间长有关。该研究结果提示加热和加辅料炮制可起到一定的“杀酶保苷”作用，但此3种化学成分含量的变化是否是其传统功效发生改变的物质基础，值得进一步结合相关的药理药效指标进行深入研究，以期为其不同炮制品的临床合理使用提供科学依据。

本研究结果表明不同炮制方法对广山楂的3种化学成分产生了一定影响，盐炙等炮制方法可提高样品中儿茶素、柚皮苷、根皮苷含量，炒炭法则使柚皮苷、根皮苷含量降低，可为广山楂的研究提供一定参考。