张宏伟，莎日娜，郑文杰，王硕

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.天津出入境检验检疫局，天津300461；3.天津医学高等专科学校，天津300222）

小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica），是肠杆菌科、耶尔森菌属的一个种，广泛分布于自然界的土壤、水体中，野生动物，家畜，昆虫中均有检出，生存温度从0℃～40℃，在0℃～40℃环境中保持生命力可达18个月之久，-25℃能存活24 h以上，这种嗜冷性质决定了保存在4℃～5℃冰箱中的食品更具有传染的危险性。

小肠结肠炎叶尔森氏菌是一种急性胃肠炎型食物中毒病原菌，可致人畜患病。耶尔森氏菌病典型症状为胃肠炎、发热，亦可引起阑尾炎和反应性关节炎，另一个并发症是败血症，死亡率较高。经典检测方法耗时长，步骤繁多，操作复杂，成本高昂，不能满足快速鉴定食品中是否污染该菌的要求，本研究旨在应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术建立检测方法，结合免疫金试纸条检测方法，避免PCR方法结果检测需要电泳使用溴化乙锭（ethidium bromide，EB）、PCR产物污染等问题，探索建立一种快速准确避免污染的检测方法，便于在实验室推广应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

基因组提取试剂盒：Promega公司；HS Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL）：大连宝生物公司；引物合成由上海生物工程公司完成；核酸快速检测试纸条：优思达公司。

菌株采用4株美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）菌株和22株中国医学细菌保藏管理中心（national center for medical culture collections，CMCC）小肠结肠炎耶尔森氏菌标准菌株，9株其它耶尔森氏菌属标准菌和其它菌属17株ATCC标准菌株，具体见表1。

表1 试验菌株Table 1 Bacterial strains for detection

1.2 仪器与设备

PrC-200热循环仪：MJ公司；1510核酸蛋白分析仪：赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计

利用细菌16s-23srDNA间区序列设计特异性引物见表2，引物组合见表3。在引物合成时，一条引物的5’端标记异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），另一条引物的 5’端标记地高辛（Digoxin）。

表2 引物序列Table 2 Primers sequence

表3 16s-23s rDNA间区引物组合Table 3 Detection primer combination

1.3.2 反应体系

体系的构成如下：10×buffer，5 μL；引物（10 μmol/L）各 2 μL；dNTP（10 mmol/L），1 μL；模板 DNA，2 μL；Taq酶（5 U/μL），1 μL；ddH2O，37 μL。

反应条件：94℃预变性10 min；扩增循环：94℃30 s，56℃温度退火 15 s，72℃延伸 60 s，进行 30个循环，72℃延伸5 min，4℃保存。

1.3.3 特异性试验

利用表1中的标准菌株对引物分别进行特异性试验，以筛选出通用性好，特异性强的引物。

1.3.4 灵敏度试验

取1 mL标准菌株增菌液用于提取基因组DNA，利用紫外分光光度计检测DNA质量及纯度。将PCR模板进行10倍梯度稀释，按建立方法扩增，同时用凝胶电泳和胶体金试纸条方法观察检测结果。

1.3.5 样品加菌试验

3份经证实未污染结肠炎耶尔森氏菌的碎肉样品，1份作为对照样品，2份各25 g分别接种1 mL不同浓度小肠结肠炎耶尔森氏菌液和1 mL 10倍浓度的大肠埃希菌和金葡菌菌液，混匀后进行检测。

1.3.6 市售样品检测

利用建立的方法对市场购买的样品进行检测，并与GB 4789.8-2016《食品安全国家标食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》进行比较。

2 结果与分析

2.1 特异性引物的确定

应用温度梯度PCR，分别用9对引物进行PCR检测，发现S1/A2引物组合在56℃退火时特异性最好，实验用近缘菌株都无假阳性出现，而小肠结肠炎耶尔森氏菌都出现特异性泳带。因此，本研究选择S1/A2作为小肠结肠炎耶尔森氏菌PCR检验的特异性引物，退火温度确定为56℃，其扩增产物为282 bp。

2.2 特异性试验

小肠结肠炎耶尔森氏菌标准菌株检测结果均为阳性结果，耶尔森氏菌其他属标准菌株及对照标准菌株检测结果均为阴性，部分检测结果见图1、图2。

图1 特异性检测结果Fig.1 Detece of specificity by electrophoresis

图2 对照菌株特异性检测结果Fig.2 Detece of specificity by nucleic acid strips

检测结果显示小肠结肠炎标准菌株检测没有出现假阴性结果，耶尔森氏菌属其他种的标准菌株及对照标准菌株检测均没有出现假阳性结果，说明引物特异性良好，试纸条显示的检测结果与电泳结果相符合，表明其检测特异性良好。

2.3 灵敏度试验

模板稀释倍数分别为 100、10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7μg/mL，检测结果见图 3。

图3 灵敏度检测结果Fig.3 Detece of sensitivity

检测结果表明，随着稀释度的增加，检测条带逐渐减弱，当稀释浓度达到10-3μg/mL时，电泳检测结果显示为阴性，而试纸条则有淡红色条带出现，说明试纸条检测灵敏度较电泳方法高一个数量级，可达到10-3μg/mL。

2.4 样品加菌试验

添菌灵敏度检测结果见图4。

图4 添菌灵敏度检测结果Fig.4 Detece of sensitivity in samples

检测结果表明，尽管有高浓度的干扰菌存在，电泳检测灵敏度可达到101CFU/mL，而试纸条检测灵敏度较电泳检测高一个数量级，达到了100CFU/mL。

2.5 市售样品检测

用PCR-试纸条法对市售722份水产及禽畜肉进行检测，并与国标方法检测结果进行比较，结果见表4。

表4 市售样品检测结果Table 4 Detection result of samples

检测结果表明，PCR-试纸条方法检测阳性率高于国标方法。以国标方法为基准方法，对新建立的方法进行评估，见表5。

表5 PCR-试纸条方法评估表Table 5 Assessment of PCR-immunoblotting strips method

3 讨论

检测假阳性的发生可能因素包括：（1）如果检测中多对引物相互反应，出现引物二聚体则可能导致假阳性结果。（2）样品中存在目标菌死菌，作为较为灵敏的核酸检测方法，检测到死菌信号。（3）传统的检测方法对检验人员的经验要求较高，如果检验人员经验不足，则使用经典检测方法有可能造成漏检。使用PCR-试纸条方法作为筛选方法，可以弥补检验人员因经验不足造成的漏检情况。以本研究建立的快速方法检测到阳性结果，需要用国标方法加以确认，以国标方法检测作为判定依据。

国家标准小肠结肠炎耶尔森氏菌耶尔森氏检测方法至少需要7天完成检测、容易发生检测人员因经验不足造成漏检，采用本研究建立的检测方法特异性强，灵敏度高，可在24小时内得到检测结果。本研究采用试纸条代替凝胶电泳，既减少了PCR产物的二次污染，又避免了EB对人体的伤害和对环境的污染，是传统方法的有益补充。