刘春宇，朱振元，孙会轻，王淮旭，张立娟

（食品营养与安全国家重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

蛹虫草（Cordyceps militaris），又名北冬虫夏草，与冬虫夏草同属异种是一种名贵的中草药[1]。蛹虫草含有虫草多糖、虫草素、核苷类、甾醇类等营养成分和人体必需的氨基酸、维生素和过氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等多种生物活性物质[2]。多糖是蛹虫草提取物的重要活性成分之一，研究表明，蛹虫草多糖具有免疫调节作用、抗癌作用、抗氧化作用、降血糖功能、对肝炎的治疗作用以及对酒精所致肝损伤的保护作用等生物活性功能[3-5]。目前蛹虫草产品开发主要集中在虫草酒制品、胶囊保健品、蛹虫草保健酱油等方面，但关于便携式功能食品尤其是速溶性固体饮料功能食品的开发较少。因此本文用蛹虫草提取物复配山楂提取物制备固体饮料，不仅提高固体饮料的营养价值，同时开拓了蛹虫草新产品加工新途径，具有广阔的市场前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草子实体：天津东方中滨农业科技有限公司；山楂：市售一级；木糖醇购：安徽丰原发酵技术工程研究有限公司；柠檬酸：北京北方霞光食品添加剂有限公司。以上原料均为食品级。

1.2 材料与设备

ESJ205-4电子天平：沈阳龙腾电子标量仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；冷冻干燥机：美国Thermo公司；LD4-40型低速大容量离心机：北京医用离心机厂；SP-2102UV型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.3 蛹虫草提取物的制备

1.3.1 工艺流程

蛹虫草子实体→粉碎、过筛→提取→离心→浓缩→醇沉→离心→冻干→蛹虫草提取物

1.3.2 试验步骤

将干燥的蛹虫草子实体用粉碎机粉碎，过80目筛，精确称取一定质量的蛹虫草粉末，按固液比1∶10（g/mL）比例加入蒸馏水，在80℃水浴条件下提取2 h，在4 000 r/mim条件下离心10 min，收集上清液，固体沉淀重复提取2次，合并上清液；将蛹虫草提取液进行旋蒸、浓缩；以1∶4（浓缩液∶无水乙醇，体积比）的比例向浓缩液中加入无水乙醇，对浓缩液进行醇沉处理；醇沉24 h后，将醇沉体系在4 000 r/min条件下离心10 min，弃去上清液，收集所得沉淀，沉淀用真空冷冻干燥机进行冻干，得到淡黄色无味粉末，为蛹虫草提取物，记录蛹虫草提取物的质量计算其得率，并用于后续试验。

1.4 山楂提取物的制备

1.4.1 工艺流程

山楂→清洗→烘干→去核→粉碎、过筛→提取→离心→浓缩→醇沉→离心→冻干→山楂提取物

1.4.2 试验步骤

将山楂清洗、去核后烘干，用粉碎机粉碎，过80目筛，精确称取一定质量的山楂粉末，参考1.3.2步骤对山楂粉末进行提取，冻干后得到浅黄色粉末，为山楂提取物，记录山楂提取物的质量计算其得率，并用于后续试验。

1.5 蛹虫草提取物、山楂提取物有效成分含量的测定

分别精确称取蛹虫草提取物、山楂提取物5 mg，加入少量蒸馏水溶解，定容至5 mL，得到浓度为1 mg/mL的蛹虫草提取物溶液和山楂提取物溶液，分别对其总糖、还原糖、蛋白质及黄酮含量进行测定。

1.5.1 总糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法[6]分别测定蛹虫草提取物、山楂提取物中可溶性总糖含量。

1.5.2 还原糖含量的测定

采用 3，5-二硝基水杨酸 （3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[7]分别测定蛹虫草提取物、山楂提取物中还原糖含量。

1.5.3 蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝（G-250）法[8]分别测定蛹虫草提取物、山楂提取物中可溶性蛋白质含量。

1.5.4 黄酮含量的测定

采用芦丁比色法[9]分别测定蛹虫草提取物、山楂提取物中黄酮含量。

1.6 蛹虫草山楂固体饮料的评定标准

参照GB/T 17321-2012《感官分析方法二-三点检验》[10]和GB/T 21172-2007《感官分析食品颜色评价的总则和检验方法》[11]中感官分析标准，制定《蛹虫草、山楂提取物固体饮料的评定标准》。将冲泡好的固体饮料，由10名（5男5女）感官评价人员对其进行感官评分，每次评分前用温开水漱口。评定标准如表1所示，按照如下标准，分为4个等级，分别对其评分。综合感官评价分值＝20%×外观形态评分＋20%×色泽评分＋20%×风味评分＋40%×口感评分[12]。

表1 蛹虫草、山楂提取物固体饮料的评定标准Table 1 The evaluation criteria of Cordyceps militaris extract and hawthorn extract solid beverages

1.7 蛹虫草、山楂提取物固体饮料单因素试验

1.7.1 蛹虫草提取物添加量对饮料感官评分的影响

蛹虫草提取物添加量分别为 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g，山楂提取物添加量为2.0 g，柠檬酸添加量为0.08 g，木糖醇添加量为2.0 g，将复配好的样品溶于100 mL热水中，对饮料进行感官评价，每组试验重复3次。以感官评分为指标，确定蛹虫草提取物的最适添加量。

1.7.2 山楂提取物添加量对饮料感官评分的影响

山楂提取物添加量分别为 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g，蛹虫草提取物添加量为0.5 g，柠檬酸添加量为0.08 g，木糖醇添加量为2.0 g。参照1.7.1步骤，确定山楂提取物的最适添加量。

1.7.3 木糖醇添加量对饮料感官评分的影响

木糖醇添加量分别为 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g，蛹虫草提取物添加量为0.5 g，山楂提取物添加量为2.0 g，柠檬酸添加量为0.08 g。参照1.7.1步骤，确定木糖醇的最适添加量。

1.7.4 柠檬酸添加量对饮料感官评分的影响

柠檬酸添加量分别为 0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 g，蛹虫草提取物添加量为0.5 g，山楂提取物添加量为2.0 g，木糖醇添加量为2.0 g。参照1.7.1步骤，确定柠檬酸的最适添加量。

1.8 蛹虫草、山楂提取物固体饮料正交试验设计

为使蛹虫草、山楂提取物固体饮料口感达到最佳，在单因素试验基础上，进行L9（34）正交试验，以感官评价为指标，得出蛹虫草、山楂提取物固体饮料的最佳配方，正交试验因素与水平设计见表2。

表2 正交试验因素与水平设计Table 2 Design of orthogonal experiment factors and levels

1.9 蛹虫草、山楂提取物固体饮料理化性质的测定

1.9.1 固体饮料粉润湿性的测定

称取0.500 g样品均匀平铺于200 mL蒸馏水水面上，记录样品从加入至完全沉降所需要的时间（s）。

1.9.2 固体饮料分散性的测定

称取5.000 g样品加入50 mL蒸馏水，在恒温磁力搅拌器上搅拌，记录从搅拌开始到粉块全部分散所需要的时间（s）。

1.9.3 固体饮料粉溶解度的测定

精确称量样品5.000 g，置于50 mL小烧杯中，加入蒸馏水30 mL，在25℃条件下用磁力搅拌器搅拌30 min，使蛹虫草、山楂提取物固体饮料充分溶解。将溶液转移至容量瓶中，并用蒸馏水定容至50 mL，充分摇匀。取15 mL溶解液，放入离心管中，3 000 r/mim离心10 min，取上清液，将其全部转移至干燥的称量皿中，放入105℃干燥箱中烘干至质量恒定[13]。

式中：X为样品溶解度，g/100 g；M为样品质量，g；m1为称量皿质量，g；m2为称量皿和不溶物干燥后质量，g；B为样品水分含量，%。

1.10 蛹虫草、山楂提取物固体饮料感官、理化和微生物指标检验

水分含量测定，参照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的直接干燥法；铅（以Pb计）测定，参照GB 5009.12-2017《食品安全国家标准食品中铅的测定》；总砷（以As计）测定，参照GB 5009.11-2014《食品安全国家标准食品中总砷及无机砷的测定》；菌落总数测定，参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》；大肠菌群测定，参照GB 4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》；霉菌和酵母菌测定，参照GB 4789.15-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》；致病菌限量测定，参照GB 29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草提取物、山楂提取物得率

蛹虫草子实体粉末与山楂粉末经水提醇沉、真空冷冻干燥后得到蛹虫草提取物及山楂提取物。经计算，蛹虫草提取物及山楂提取物的得率分别为6.72%和23.79%。

2.2 蛹虫草提取物、山楂提取物有效成分含量

2.2.1 标准曲线

参照1.5中方法，测定总糖含量和还原糖含量的葡萄糖标准曲线回归方程分别为y=0.010 1x+0.022 9（R2=0.999 2）和 y=0.001 1x-0.031 3（R2=0.999 2）；测定蛋白质含量的牛血清蛋白标准曲回归方程为y=0.005 7x+0.006 5（R2=0.999 1）；测定黄酮含量的芦丁标准曲线回归方程为y=2.107x-0.083 7（R2=0.999 0）。综上所述，各标准曲线的回归方程具有良好的线性关系，可用于指标的测定。

2.2.2 有效成分含量

蛹虫草提取物和山楂提取物中有效成分测定，结果如表3所示。

表3 蛹虫草提取物、山楂提取物有效成分含量Table 3 The active ingredient contents of Cordyceps militaris extract and hawthorn extract%

由表3可得，蛹虫草提取物和山楂提取物的主要成分均为糖类物质，其中多糖类物质的含量分别为37.63%和35.70%；据报道，山楂多糖具有抗氧化[14]、抗疲劳[15]、降血压[16]、降血脂[17]等作用；蛹虫草多糖具有抗氧化、降血糖、保肝、抗肿瘤等生物活性。其次为蛋白类物质；除此之外还含有少量黄酮类物质。

2.3 蛹虫草、山楂提取物固体饮料单因素试验

2.3.1 蛹虫草提取物添加量对饮料感官评分的影响

蛹虫草提取物添加量对饮料感官评分的影响如图1所示。

图1 蛹虫草提取物添加量对产品感官评分的影响Fig.1 Influence of Adding Amount of Extract from Cordyceps militaris on Sensory Score

由图1可知，饮料的感官评分随蛹虫草提取物添加量的增加呈先增长后降低的趋势，在蛹虫草提取物添加量为0.5 g时达到最大（93.9±1.9），且与其他组具有极显著差异。因此，蛹虫草提取物的最适添加量为0.5 g。

2.3.2 山楂提取物添加量对饮料感官评分的影响

山楂提取物添加量对饮料感官评分的影响如图2所示。

由图2可知，饮料的感官评分随山楂提取物添加量的增加呈先增长后降低的趋势，在山楂提取物添加量为2.0 g时达到最大（91.9±1.5），且与其他组具有极显著差异。山楂提取物溶于水后味道偏酸，会对饮料的味道产生显著影响。因此，山楂提取物的最适添加量为2.0 g。

图2 山楂提取物添加量对产品感官评分的影响Fig.2 Influence of adding amount of extract from hawthorn on sensory score

2.3.3 木糖醇添加量对饮料感官评分的影响

木糖醇添加量对饮料感官评分的影响如图3所示。

图3 木糖醇添加量对产品感官评分的影响Fig.3 Influence of adding amount of xylitol on sensory score

由图3可知，在木糖醇添加量为1.0 g～2.0 g范围内，饮料的感官评分呈上升的趋势；在木糖醇添加量为2.0 g和2.5 g时，感官评分没有差异；在木糖醇添加量为3.0 g时感官评分显著下降。木糖醇可以增加饮料的甜度，但过量的木糖醇会使饮料甜度过大，影响产品的口味。因此，木糖醇的最适添加量为2.0 g。

2.3.4 柠檬酸添加量对饮料感官评分的影响

柠檬酸添加量对饮料感官评分的影响如图4所示。

由图4可知，当柠檬酸添加量在0.06 g和0.08 g时，饮料的感官评分没有显著差异，但极显著优于其他组。适量的柠檬酸可以调节产品的酸味，但过量添加会使产品的酸度过大，影响其口感。因此，柠檬酸的最适添加量为0.06 g。

2.4 蛹虫草、山楂提取物固体饮料正交试验

图4 柠檬酸添加量对产品感官评分的影响Fig.4 Influence of adding amount of citric acid on sensory score

由单因素试验结果得出，蛹虫草提取物添加量、山楂提取物添加量、木糖醇添加量、柠檬酸添加量均对饮料的感官评分有显著影响，因此在单因素试验的基础上进行正交试验，以感官评价为指标，对蛹虫草提取物添加量、山楂提取物添加量、木糖醇添加量、柠檬酸添加量四因素进行L9（34）正交试验，优化蛹虫草、山楂提取物固体饮料的最佳配方。利用SPSS18.0对试验结果进行分析，正交试验结果直观分析结果和方差分析结果分别如表4和表5所示。

表4 正交试验结果与分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experimental

表5 正交实验结果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experimental

由表4和表5可以看出，4个因素对饮料的感官评分都有显著的影响，主次顺序为A（蛹虫草提取物添加量）＞D（柠檬酸添加量）＞B（山楂提取物添加量）＞C（木糖醇添加量），最小的是木糖醇的添加量。得到饮料的最佳配比为A2B2C2D1，即蛹虫草提取物0.5 g、山楂提取物2.0 g、木糖醇2.0 g、柠檬酸0.05 g。按以上条件进行验证试验，得出感官评分的平均值为95.42，高于表4中的试验结果，因此，蛹虫草、山楂提取物固体饮料的最佳配比为：蛹虫草提取物0.5 g、山楂提取物2.0 g、木糖醇 2.0 g、柠檬酸 0.05 g。

2.5 蛹虫草、山楂提取物固体饮料理化性质

经测定，蛹虫草、山楂提取物固体饮料润湿性为63 s，分散性为46 s，溶解度为98.35%。样品溶于水后，润湿和分散时间较短，溶解度越较大，说明该固体饮料的溶解性越好。

该固体饮料颗粒均匀、细腻，水分含量低，且未添加任何添加剂；在冲泡后，能均匀的溶于热水中，不结块、不沉淀，说明产品具有良好的流动性、分散性及稳定性。

2.6 蛹虫草、山楂提取物固体饮料感官、理化和微生物指标

2.6.1 感官指标

蛹虫草、山楂提取物固体饮料为红棕色、均匀一致的固体，该配方冲调于100 mL热水，溶解性好；口感圆润、酸甜适度，蛹虫草山楂混合香气浓郁。

2.6.2 理化指标

经测试，蛹虫草、山楂提取物固体饮料水分含量≤5%；总砷含量（以 As计）≤0.5 mg/kg；铅（Pb）含量≤1.0 mg/kg，理化指标符合GB/T 29602-2013《固体饮料》标准。

2.6.3 微生物指标

经测试，蛹虫草、山楂提取物固体饮料菌落总数≤1 000 CFU/g；大肠菌群≤40 MPN/100 g；霉菌和酵母菌≤50 CFU/g；致病菌未检出，微生物指标符合国家标准。

3 结论

本试验采用水提醇沉法得到蛹虫草提取物和山楂提取物，两种提取物中主要含有多糖、蛋白质、黄酮等活性成分，因此以蛹虫草提取物、山楂提取物为主要原料进行蛹虫草、山楂提取物固体饮料制备工艺研究。通过单因素、正交试验得到最佳配方为蛹虫草提取物添加量0.5 g、山楂提取物添加量2.0 g、木糖醇添加量2.0 g、柠檬酸添加量0.05 g。将此配方溶于100 mL热水中，得到溶解性、分散性、流动性、稳定性良好，营养丰富，酸甜可口，具有蛹虫草独特风味，便于携带的固体饮料。适合各类人群，是具有开发前景的一种功能饮品。