王小明，陈碧，钟翠娟，覃逸明，廖政达，谢济运

（1.广西科技师范学院食品与生化工程学院，广西来宾546199；2.广西科技师范学院科学技术与信息化处，广西来宾546199）

甜茶（Rubus Suavissimus S.Lee），又名甜叶悬钩子，属蔷薇科，为悬沟子属多年生灌木，是我国西南地区特有的药食同源植物，甜茶全身都是宝，根、茎、叶、果实等都可入药，甜茶中含有的类黄酮、茶多酚等物质，除具有普通绿茶的功效外，还具有防治高血压、高血脂、心血管疾病和防癌抗癌等药效，因此，甜茶在民间被称之为“神茶”，另外甜茶作为一种天然的甜味料与食品，在西南地区民间应用已有几百年的悠久历史[1-3]。黄酮类化合物是一类广泛分布于植物体内的多酚类物质，是一类植物次级代谢产物，其主要类型有黄酮、黄酮醇、异黄酮、双黄酮和二氢黄酮等，黄酮类化合物是甜茶中重要活性成分之一，从甜茶中提取的黄酮类化合物即为甜茶总黄酮[4-6]。

本研究采用单因素试验与均匀设计试验相结合的方法[7]，以粉碎的干甜茶叶粉为原料，以乙醇为萃取溶剂，以甜茶叶中总黄酮的提取得率为指标，研究了纤维素酶-乙醇提取法、乙醇热回流提取法和超声波-乙醇提取法对甜茶总黄酮提取得率的影响，并对均匀设计试验数据进行回归分析和二次多项式逐步回归分析研究。均匀设计法适合在考察因素多、水平多的情况下用较少的试验次数得到较优工艺条件，对比正交试验法、旋转正交试验法、响应面分析法等具有方便和迅速的优势，并能将各试验因素按重要性排序[8-10]。研究得出上述3种方法提取甜茶总黄酮的较优工艺条件，并对这3种方法在其各自的较优工艺条件下的提取得率进行对比分析，为我国西南地区甜茶总黄酮的提取利用提供更多理论和可行性操作方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜茶叶采摘于广西金秀瑶族自治县莲花山，甜茶鲜叶清洗干净后于60℃以下低温烘干，在粉碎机中粉碎备用。

芦丁标准品（纯度＞99%）：Sigma公司；纤维素酶：山东西唐生物科技有限公司；无水乙醇、硝酸铝[Al（NO3）3]、亚硝酸钠（NaNO2）、氢氧化钠（NaOH）：均为分析纯。

UV-1800双光束紫外可见分光光度计：日本岛津；HH-2数显电子恒温水浴锅：江苏省金坛市友联仪器研究所；FS-1500超声波萃取仪：上海生析超声仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：上海姚氏仪器设备厂；Z206A台式小型离心机：上海赵迪生物科技有限公司；XFB-200小型植物粉碎机：长沙市雨花区中诚制药机械厂。

1.2 试验方法

1.2.1 总黄酮含量的测定方法[11-14]

准确称取芦丁标准品2.500 0 mg，转入25 mL容量瓶中，以60%乙醇溶解并定容，配制得0.100 0 mg/mL芦丁标准溶液。准确移取芦丁标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置10 min；再加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置10 min；再加4%氢氧化钠溶液4 mL，以60%乙醇定容，摇匀，静置20 min，从200 nm～700 nm进行全波长扫描，均测得在510 nm处有最大吸光度，因此选定以510 nm为芦丁和总黄酮浓度的测定波长。在510 nm波长下测各容量瓶中溶液的吸光度，以芦丁浓度（y）和吸光度（x）进行线性回归，得线性回归方程：y=0.081 9x+0.000 1，R2=0.999 8。

1.2.2 甜茶叶中总黄酮含量测定方法

将甜茶叶按不同条件提取的各份提取液过滤离心，按1.2.1中的方法显色后定容为样品液，以蒸馏水作空白对照，于510 nm波长下测定样品液吸光度，将测得的吸光度值代入标准曲线的线性回归方程，得到样品液的浓度，并按下面的公式计算得到甜茶叶（样品液）总黄酮含量（mg）和总黄酮提取得率（%）。

式中：C为样品液的浓度，mg/mL；V为提取溶液定容的体积，mL；W为甜茶叶的重量，mg。

1.2.3 甜茶叶总黄酮提取工艺流程[15-16]

干燥的甜茶叶→粉碎过筛→分别采取3种提取方法→提取液过滤离心→收集上清液定容→按1.2.1显色→按1.2.2测定甜茶叶（样品液）中的总黄酮含量→按1.2.2计算甜茶叶（样品液）的提取得率（%）

1.2.3.1 维素酶-乙醇提取法

分别准确称取过50目筛的甜茶叶粉各0.5 g，装入圆底烧瓶中，并依次加入一定比例量的纤维素酶，加20 mL缓冲液溶解并调节pH值，置于恒温水浴锅中酶解一定时间后取出，然后将酶解液转移到容量瓶中，加入20 mL 60%乙醇浸提溶剂，再次置于65℃恒温水浴锅中回流提取65 min后过滤提取液，于4 500 r/min离心分离，收集上清液定容，测定总黄酮含量并计算出甜茶叶中总黄酮提取得率。

1.2.3.2 乙醇热回流提取法

分别准确称取过50目筛的甜茶叶粉各0.5 g，装入圆底烧瓶中，按一定量加入一定浓度乙醇浸提溶剂，置于恒温水浴锅中回流提取一定时间后过滤提取液，于4 500 r/min离心分离，收集上清液定容，测定总黄酮含量并计算出甜茶叶中总黄酮提取得率。

1.2.3.3 超声波-乙醇提取法

分别准确称取过50目筛的甜茶叶粉各0.5 g，装入圆底烧瓶中，按一定量加入一定浓度乙醇浸提溶剂，在超声波萃取仪中用一定功率，置于恒温水浴锅中超声波萃取一定时间后过滤提取液，于4 500 r/min离心分离，收集上清液定容，测定总黄酮含量并计算出甜茶叶中总黄酮提取得率。

1.3 数据处理

每组试验均进行3次平行或重复试验[17]，试验数据采用Microsoft Excel 2010软件、均匀设计（Uniform Design）分析软件、Origin8绘图软件和DPS SOFT7.5进行分析。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶-乙醇提取法

分别准确称取过50目筛的甜茶叶粉各0.5 g，装入圆底烧瓶中，以甜茶叶中提取的总黄酮得率为指标进行单因素试验，分别研究各单因素对纤维素酶-乙醇提取法提取甜茶叶总黄酮的影响。初始条件分别取：纤维素酶添加量3.5 mg、酶解液pH5.0、料液比1 ∶20（g/mL）、酶解温度 40℃、酶解时间 50 min。选取各因素变量 X1、X2、X3、X4、X5 分别为：纤维素酶添加量（1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mg）、酶解液 pH 值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，由缓冲液调节酶解液 pH值）、酶解温度（20、30、40、50、60 ℃）、酶解时间（20、35、50、65、80 min），进行单因素试验。纤维素酶-乙醇提取法各单因素试验结果如图1。

根据四因素十水平的均匀设计，选取均匀设计表U*10（108）。由均匀设计使用表查到，当因素数为4时，应将各因素依次分别放在U*10（108）表的1、3、4、5列上，其试验设计和结果如表1、方差分析结果如表2、回归分析结果如表3。

由图1可知，纤维素酶-乙醇提取法单因素试验中，酶添加量最佳值为3.5 mg、酶解液pH值最佳值为5.0、酶解温度最佳值为40℃、酶解时间最佳值为65 min。

图1 纤维素酶-乙醇提取法各单因素对提取得率的影响Fig.1 Effect of single factor of cellulase ethanol extraction on extraction yield

表1 纤维素酶-乙醇提取法均匀设计U*10（108）和结果Table 1Cellulase ethanol extraction uniform design U*10（108）and results

表2 纤维素酶-乙醇提取法方差分析结果表Table 2 Results of variance analysis of cellulase and ethanol extraction

表3 纤维素酶-乙醇提取法回归分析结果表Table 3 Results of regression analysis of cellulase and ethanol extraction

在单因素试验中各因素最佳值上下近间隔取值，选取四因素十水平的均匀设计表U*10（108）。由表1、表2、表3可知，运用Excel对上述试验结果进行回归分析，回归方程的表达式为：Y=4.404+0.568 Z1+0.794 Z2-0.047 Z3+0.022 Z4。由于复相关系数R=0.969，P值不显著的概率＜0.01，所以所建立的四元一次方程非常显著，与试验数据拟合很好。根据分析结果中各偏回归系数对应的t检验值，因素主次顺序为：酶解液pH值（Z2）＞酶添加量（Z1）＞酶解温度（Z3）＞酶解时间（Z4）。根据 P 值可知，酶解液pH值对试验结果有非常显著的影响，酶添加量、酶解温度对试验结果有显著的影响。运用Excel中的“规划求解”工具，规划求解得到本试验的优化工艺条件：酶添加量为4.3 mg、酶解液pH值为5.8、酶解温度为30℃、酶解时间为77 min，将这些数值代入回归方程得Y=11.74%，它优于表2中任一试验结果。经验证试验，该工艺条件的实际提取得率平均为10.67%，小于表1中第10号试验结果，因为各因素已经是在单因素试验中各因素最佳值上下近间隔取值，采用直观分析法，第10号试验设计的提取得率最大，所以可以确定第10号试验对应的试验条件作为纤维素酶-乙醇提取法的较优工艺，工艺条件：酶添加量为4.3 mg（0.86%）、酶解液pH值为5.4、酶解温度为42℃、酶解时间为65 min，此条件下甜茶总黄酮提取得率最大为10.89%。

2.2 乙醇热回流提取法

分别准确称50目筛的甜茶叶粉各0.5 g，装入圆底烧瓶中，以甜茶叶中提取的总黄酮得率为指标进行单因素试验，分别研究各单因素对乙醇热回流提取法提取甜茶叶总黄酮的影响。初始条件分别取：乙醇浓度65%、甜茶叶与乙醇料液比1∶30（g/mL）、水浴温度70℃、提取时间80 min。选取各因素变量X1、X2、X3、X4、X5、X6分别为：乙醇浓度（35%、45%、55%、65%、75%、85%）、料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）]、提取温度（40、50、60、70、80、90 ℃）、提取时间（40、60、80、100、120、140 min），进行单因素试验。过滤提取液，于4 500 r/min离心分离，收集上清液定容，测定总黄酮含量并计算出甜茶叶中总黄酮的提取得率。乙醇热回流提取法各单因素试验结果如图2。

根据四因素十水平的均匀设计，选取均匀设计表U*10（108）。由均匀设计使用表查到，当因素数为4时，应将各因素依次分别放在U*10（108）表的1、3、4、5列上，其试验设计和结果如表4、方差分析结果如表5、回归分析结果如表6。

图2 乙醇热回流提取法各单因素对提取得率的影响Fig.2 Effect of single factor of ethanol reflux extraction on extraction yield

表4 乙醇热回流提取法均匀设计U*10（108）和结果Table 4Uniform design of ethanol reflux extraction U*10（108）and results

表5 乙醇热回流提取法方差分析结果表Table 5 Results of variance analysis of ethanol reflux extraction method

由图2可知，乙醇热回流提取法单因素试验中，乙醇浓度最佳值为55%、料液比最佳值为1∶50（g/mL）、提取温度最佳值为70℃、提取时间最佳值为100 min。

表6 乙醇热回流提取法回归分析结果表Table 6 Regression analysis results of ethanol reflux extraction method

在单因素试验中各因素最佳值上下近间隔取值，选取四因素十水平的均匀设计表U*10（108）。由表4、表5、表6可知，运用Excel对上述试验结果进行回归分析，回归方程的表达式为：Y=12.987+0.035 Z1-148.762 Z2-0.030 Z3+0.010 Z4。由于复相关系数R=0.993，P值不显著的概率＜0.000 1，所以所建立的四元一次方程高度（十分）显著，与试验数据拟合很好。根据分析结果中各偏回归系数对应的t检验值，因素主次顺序为：料液比（Z2）＞乙醇浓度（Z1）＞提取时间（Z4）＞提取温度（Z3）。根据P值可知，料液比对试验结果有高度显著的影响，乙醇浓度、提取温度、提取时间对试验结果有非常显著的影响。运用Excel中的“规划求解”工具，规划求解得到本试验的较优工艺条件为：乙醇浓度为63%、料液比为1∶58（g/mL）、提取温度为60℃、提取时间为120 min，将这些数值代入回归方程得Y=12.03%，它优于表4中任一试验结果。经验证试验，该工艺条件的实际提取得率平均为11.53%，仍优于表4中任一试验结果，因为各因素已经是在单因素试验中各因素最佳值上下近间隔取值，所以可以确定乙醇热回流提取法的较优工艺条件：乙醇浓度为63%、料液比为1 ∶58（g/mL）、提取温度为 60℃、提取时间为 120 min，此条件下甜茶总黄酮提取得率最大为11.53%。

2.3 超声波-乙醇提取法

分别准确称取过50目筛的甜茶叶粉各0.5 g，装入圆底烧瓶中，以甜茶叶中提取的总黄酮得率为指标进行单因素试验，分别研究各单因素对超声波-乙醇提取法提取甜茶叶总黄酮的影响。初始条件分别取：乙醇浓度60%、甜茶叶与乙醇料液比1∶30（g/mL）、超声波功率70 W、提取温度40℃、提取时间50 min。选取各因素变量 X1、X2、X3、X4、X5、X6 分别为：乙醇浓度（25%、35%、45%、55%、65%、75%）、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）]、超声波功率（30、45、60、75、90、115 W）、提取温度（0、15、30、45、60、75 ℃）、提取时间（10、20、30、40、50、60min），进行单因素试验。过滤提取液，于4 500r/min离心分离，收集上清液定容，测定总黄酮含量并计算出甜茶叶中总黄酮的提取得率。超声波-乙醇提取法各单因素试验结果如图3。

根据五因素十水平的均匀设计，选取均匀设计表U*10（108）。由均匀设计使用表查到，当因素数为5时，应将各因素依次分别放在U*10（108）表的1、2、4、5、7列上，其试验设计和结果如表7、回归分析结果如表8。

图3 超声波-乙醇提取法各单因素对提取得率的影响Fig.3 Influence of single factor on extraction yield of ultrasonic ethanol extraction method

表7 超声波-乙醇提取法均匀设计U*10（108）和结果Table 7 Uniform design of ultrasonic and ethanol extraction U*10（108）and results

表8 超声波-乙醇提取法二次多项式逐步回归分析结果Table 8 Results of two step polynomial regression analysis of ultrasonic ethanol extraction method

由图3可知，乙醇热回流提取法单因素实验中，乙醇浓度最佳值为65%、料液比最佳值为1∶40（g/mL）、超声波功率75 W、提取温度最佳值为45℃、提取时间最佳值为50 min。

在单因素试验中各因素最佳值上下近间隔取值，选取四因素十水平的均匀设计表U*10（108）。使用DPS SOFT7.5（Data Processing System）数据处理系统对试验结果进行回归分析。经方差分析检验，线性回归和逐步回归方程均不显著（P值＞0.05），因此不做线性拟合，改为以表7的试验组合Z1～Z5为自变量，以提取得率Y为因变量对试验结果进行二次多项式逐步回归，建立二次多项式回归方程。并对模型进行显著性检验分析[18-19]，结果如表 8。

由DPS SOFT7.5分析得回归方程：

Y=18.814 645 45-0.224 296 363 28×Z3-0.002 031 358 597 6×Z12-0.000 051 621 429 36×Z42+0.003 866 813 704×Z1×Z3+0.114 499 978 55×Z2×Z4-0.000 368 058 155 7×Z3×Z4-0.000 414 292 281 9×Z3×Z5+0.000 903 092 816 1×Z4×Z5

由表8可知：回归模型极显著（P值=0.005 9＜0.01），回归方程的决定系数R2=0.999 993，即方程可以解释99.999 3%的提取得率数据变异，方程的拟合性非常好。因此可以用该回归方程对试验的结果进行分析预测。由表8中的t检验值和P值分析可知：在试验所选范围内，单因素对提取得率影响最大为超声波功率（Z3），达极显著水平；其他单因素均不显著。各因素的互交项显著性表现为，乙醇浓度（Z1）×超声波功率（Z3）和乙醇浓度（Z1）×乙醇浓度（Z1）的 P 值均达极显著水平；提取温度（Z4）×提取时间（Z5）、超声波功率（Z3）×提取温度（Z4）和超声波功率（Z3）×提取时间（Z5）的 P值均达显著水平；提取温度（Z4）×提取温度（Z4）和料液比（Z2）×提取温度（Z4）的P值对试验结果影响不显著。由各变量显著性P值可知对提取得率影响的大小顺序为 Z3＞Z1×Z3＞Z1×Z1＞Z4×Z5＞Z3×Z4＞Z3×Z5＞Z4×Z4＞Z2×Z4。对回归方程求最大值可以得出：用均匀设计法得出超声波-乙醇提取法对甜茶总黄酮提取得率的最佳工艺条件为：Z1=68.9，Z2=1 ∶30，Z3=73.9，Z4=62.2，Z5=67.7。即最佳工艺条件为：乙醇浓度68.9%、料液比1∶30（g/mL）、超声波功率73.9 W、提取温度62.2℃、提取时间67.7 min。在此工艺条件下，得到提取得率理论值为13.31%。通过验证试验，在此优化工艺条件下的实际提取得率平均为12.23%，相对误差仅为8.11%。且此优化工艺条件下的实际提取得率优于表7中任一试验结果，因为各因素已经是在单因素试验中各因素最佳值上下近间隔取值，所以可以确定超声波-乙醇提取法对甜茶总黄酮提取得率的较优工艺条件为：乙醇浓度为68.9%、料液比为1∶30（g/mL）、超声波功率为73.9 W、提取温度为62.2℃、提取时间为67.7 min，此条件下甜茶总黄酮提取得率最大为12.23%。

2.4 3种提取方法比较

按照3种提取方法的较优工艺条件分别进行3次平行试验，平行试验结果如表9，方差分析结果如表10。

表9 3种提取方法平行试验结果Table 9 Parallel experimental results of three extraction methods

表10 3种提取方法平行试验方差分析Table 10 Parallel experimental variance analysis of three extraction methods

由表9可知，超声波-乙醇提取法提取得率平均为12.23%＞乙醇热回流提取得率平均为11.53%＞纤维素酶-乙醇提取法提取得率平均为10.89%。由表10可知，P 值=2.43×10-5＜0.000 1，表明 3 种提取方法对甜茶叶总黄酮提取得率的影响差异达到了高度（十分）显著水平。

3 结论

通过对甜茶叶中总黄酮的纤维素酶-乙醇提取法、乙醇热回流提取法和超声波-乙醇提取法各自提取工艺条件的优化及验证试验得出纤维素酶-乙醇提取法的较优工艺条件：酶添加量为4.3 mg（0.86%）、酶解液pH为5.4、酶解温度为42℃、酶解时间为65 min，此条件下甜茶总黄酮提取得率最大为10.89%；乙醇热回流提取法的较优工艺条件：乙醇浓度为63%、料液比为1∶58（g/mL）、提取温度为60℃、提取时间为120min，此条件下甜茶总黄酮提取得率最大为11.53%；超声波-乙醇提取法的较优工艺条件：乙醇浓度为68.9%、料液比为1∶30（g/mL）、超声波功率为 73.9 W、提取温度为62.2℃、提取时间为67.7 min，此条件下甜茶总黄酮提取得率最大为12.23%。3种提取方法比较，超声波-乙醇提取法提取得率平均为12.23%＞乙醇热回流提取得率平均为11.53%＞纤维素酶-乙醇提取法提取得率平均为10.89%，且3种提取方法对甜茶叶总黄酮提取得率的影响差异达到了高度（十分）显著水平。

在超声波-乙醇提取法提取甜茶叶总黄酮工艺中，单因素中对提取得率影响最大为超声波功率，达极显著水平；其他单因素均不显著。各因素的互交项显著性表现为，乙醇浓度×超声波功率和乙醇浓度×乙醇浓度对提取得率的影响均达极显著水平；提取温度×提取时间、超声波功率×提取温度和超声波功率×提取时间对提取得率的影响均达显著水平。各变量对提取得率影响的大小顺序为 Z3＞Z1×Z3＞Z1×Z1＞Z4×Z5＞Z3×Z4＞Z3×Z5＞Z4×Z4＞Z2×Z4。

4 展望

近年来，类黄酮的生理活性功能不断被研究证实[20]，学术界也掀起了对其提取和应用研究的高潮。目前涌现出了快速溶剂萃取技术[21]、超临界流体萃取法[22]、高效逆流色谱法[23]、超滤法[24]等许多高新技术，但这些技术还存在一些不容忽视的问题和局限性，比如有的提取方法仍停留于实验室研究阶段，距离真正的工业化生产还有一些关键技术阻碍等，这些障碍还有待进一步研究突破[25]。而丰富的甜茶资源多生长在我国西南边穷山区，对甜茶叶进行综合开发利用，探索新的开发技术，提取其中丰富的类黄酮资源，可以拓宽当地农民的增收途径，对扶贫攻坚和全面建成小康社会也具有重要的现实意义。