王裕鹏

(海南省洋浦经济开发区洋浦中学 578000)

人教版高中生物学教材选修3中提到，将目的基因导入植物细胞的方法中采用最多的是农杆菌转化法，其中根癌农杆菌细胞中的Ti质粒在整个转化过程中起到了关键作用。本文就Ti质粒相关知识进行梳理和总结。

1 Ti质粒的分类和结构

1.1 Ti质粒的分类 农杆菌是一类能侵染植物受损伤部位，进而引起植物细胞产生冠瘿碱和毛状根的革兰氏阴性土壤杆菌。它包括根癌农杆菌和发根农杆菌两类。而致瘤质粒(tumor-inducing plasmid，简称为Ti质粒)是根癌农杆菌细胞拟核区外分离到的一种能自主复制的双链环状DNA分子，长度约为200～250Kb。Ti质粒可以诱导植物细胞产生不同种类的冠瘿碱，根据产生冠瘿碱的类型，Ti质粒可以分为4类： 章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和琥珀碱型[1]。

1.2 Ti质粒的结构 从结构上看，Ti质粒包括T-DNA区、毒性区、接合转移区和复制起始区4部分。其中，T-DNA区和毒性区参与了外源基因的转移整合，其结构特点如下： ①T-DNA区。该区是根癌农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒在相关蛋白的作用下被切割下来整合至植物基因组的一段DNA分子。该区段分布一些与激素合成相关的基因，其表达产物能引起植物细胞激素紊乱，进而导致肿瘤的形成。由于Ti质粒类型不同，T-DNA长度也有所不同，总体介于12～24Kb之间。其最重要的区域是分别位于左右两端边界处25bp的重复序列，两者在T-DNA转移外源基因整合至植物基因组中发挥功能，其中右边界序列的作用更为重要。②毒性区(Vir区)。该区是位于T-DNA以外的一段DNA分子，长度介于30～40Kb之间。不同类型的Ti质粒Vir区结构也有所不同，以胭脂碱型Ti质粒为例，其Vir区有7个操纵子，共22个基因，分别为VirA,VirB1-VirB11,VirC1,VirC2,VirD1-D4,VirE1,VirE2,VirG,Virtzs。这些基因编码的蛋白质在T-DNA转移整合中起辅助作用，其本身不会与植物基因组整合[2]。

2 Ti质粒的转化机理

在过去的几十年间，关于根癌农杆菌转化植物细胞的分子机制得到了广泛研究。目前，人们普遍认同Ti质粒转化过程可分为8个相互关联的阶段[3]，分别为： ①当植物受到创伤后，会分泌酚类化合物，吸引农杆菌移向植物细胞，然后与植物细胞相关受体蛋白特异性结合；②VirA蛋白是位于细菌细胞膜上能识别植物酚类化合物的受体蛋白，两者结合后引发VirG蛋白的磷酸化；③由于VirG蛋白磷酸化，使其从非活性状态转变至活性状态，并作为激活因子结合至其他Vir基因的启动子上，开启Vir基因表达；④VirD1和VirD2蛋白作用于T-DNA的底链上，将其切割形成单链T-DNA分子(即T-strand)；同时VirD2蛋白以共价方式连接在T-strand的5′端，形成一个不成熟T链复合物；⑤VirD4和VirB类蛋白结合形成具有转运功能的通道，协助不成熟T链复合物和一些Vir蛋白进入植物细胞中；⑥在转运途中，VirE2蛋白包被在不成熟T链复合物上，构成成熟T链复合物；⑦成熟T链复合物和一些植物细胞蛋白(Ran、 VIP1等)进一步识别结合，协助T链复合物经核孔到达细胞核；⑧在VirD2、 VirE2和植物细胞相关蛋白的协助下，T-strand与植物细胞基因组完成整合。

3 Ti质粒在实际应用中的改造

高中生物学教材提到用于基因工程的载体分子量并不大： 如TA克隆用到的pMD19质粒长度仅有2692bp，原核表达蛋白质常用质粒pET-28a长度也只有5369bp。而Ti质粒长度约200Kb左右，片段过大，不易操作。所以野生型Ti质粒需改造才能应用于植物基因工程。

关于Ti质粒的改造方法中最常见的是双元载体系统[1]。前面提到Vir区对T-DNA的转移至关重要，但它并没有和T-DNA区连在一起。基于此，可以把这两个区段分别改造到两个质粒上。通常是将含T-DNA的质粒称之为微型Ti质粒，它缺失Vir基因，但含有复制起点、标记基因和多克隆位点，能整合外源基因。由于该质粒在大肠杆菌和农杆菌中均可以复制保存，也称之为大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒。将含一整套Vir区基因但缺失T-DNA区的质粒称之为辅助Ti质粒。两种质粒构建完成后，采用一定的方法将它们转入同一株农杆菌中，构成双元载体系统，就能使T-DNA整合至植物基因组中。此外，人们还建立了共整合载体、超级双元载体等系统。

4 Ti质粒在基因工程中的适用范围

早期研究发现，农杆菌转化法主要适用于双子叶植物和裸子植物。因为像玉米、水稻和小麦等多种单子叶植物对农杆菌的感染持抗拒态度。但是随着分子生物学的迅速发展，该项技术得到了优化，使其逐步成为转化单子叶植物的常规手段。其优化策略主要包括以下几个方面： ①添加表面活性剂增强农杆菌和植物细胞间的吸附能力；②人为提高酚类化合物的含量，更加高效地激活Vir基因表达；③采用超声波处理植物，使植物组织形成微伤口，增加农杆菌的感染几率；④添加抗氧化剂去除植物细胞由于农杆菌感染形成的过氧化物，减少植物组织培养中愈伤组织的褐化，提高转化效率[4]。

目前，农杆菌转化法的适用范围已超出了植物界，并延伸至芽殖酵母、裂殖酵母和多种丝状真菌等生物中。由于简单有效，该基因传递系统同样成为了真菌遗传改良中极为有效的工具之一[5]。更为重要的是，有人发现根癌农杆菌可以转化实验室中培养的HeLa细胞，这为研究该方法能否适用于人类细胞奠定了基础[6]。