陈 毅， 芮贝贝， 胡成穆， 蒋 磊

(1安徽省第二人民医院药学部， 合肥 230041； 2安徽医科大学药学院， 合肥 230032)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是以肝细胞脂肪变性为主要特征的临床病理综合征。由于NAFLD对生命健康的影响越来越大，日益受到人们的关注。目前，在全球普通人群中NAFLD病患病率高达30%，已成为最常见的肝脏疾病，世界范围内超过一半的人有发生NAFLD的危险[1-2]。褪黑素是哺乳动物体内产生的一种胺类激素，具有广泛的生理及药理学作用，不仅对心血管、肾脏和肝脏等器官具有保护作用，还包括调节生殖系统、免疫系统、神经系统以及抑制肿瘤细胞等功能[3]。细胞自噬是自身损坏的蛋白或细胞器被自噬小泡包裹，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，将包裹的内容物降解的过程。自噬可以实现细胞自身代谢的需要以及细胞器的更新[4]。目前自噬被普遍认为是一种机体的防御和应激调控机制，其普遍存在于机体的生理和病理过程。细胞可通过自噬来吞噬、消化和降解受损的或失去功能的细胞器、变性蛋白等生物分子，对细胞的更新、修复和重建发挥着重要的意义。本实验通过体外实验，利用HepG2细胞建立非酒精性脂肪肝模型，旨在研究褪黑素是否通过诱导自噬缓解非酒精性脂肪变性。

1 材料与方法

1.1实验材料HepG2细胞(中科院上海细胞库)，褪黑素(Sigma公司，美国)，胎牛血清(杭州四季青公司)，无血清培养基、RPMI-1640(HyClone公司)，RIPA裂解液、胰蛋白酶和SDS上样缓冲液(上海碧云天公司)，吖啶橙(acridine orange，AO)、油红O、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)，β-actin 抗体(北京中杉金桥公司)，微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3Ⅱ)抗体、p62抗体(Cell Signaling 公司)，无水乙醇为分析纯(上海化工厂)，甘油三酯(TG)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2细胞培养与分组用含10% FBS的RPMI-1640培养液培养HepG2细胞，取对数生长期的细胞进行后续实验。实验分为5组，分别为正常对照组、模型组(0.5 mmol/L油酸诱导)、褪黑素0.1、1、10 μmol/L组(油酸诱导成功后加入褪黑素处理)。

1.3肝细胞脂肪蓄积模型的建立HepG2细胞培养于六孔板中，加入0.5 mmol/L油酸诱导48 h后，观察脂肪蓄积情况，通过油红O染色评价细胞模型建立是否成功[5]。

1.4油红O染色HepG2细胞种于6孔板中(孔中置有玻片)，分组处理后用10%福尔马林溶液固定30 min，PBS洗2遍，加入油红O稀释液覆盖住板底即可，染色10 min左右，再用 75%酒精/60%异丙醇漂洗脱色，PBS洗去多余染料，甘油明胶封片。

1.5细胞内TG的检测HepG2细胞培养于24孔板中，分组培养48 h后，裂解细胞后离心取上清，再加入氯仿/甲醇(2∶1，v/v)提取细胞内TG[6]，按照试剂盒说明书操作进行检测。

1.6吖啶橙(AO)染色分析细胞HepG2细胞以一定的密度1×105～3×105/孔接种到6孔板中，分组处理后，以吖啶橙(2 μg/mL)染色15 min(避光)，PBS洗涤，荧光显微镜观察。自噬溶酶体呈橙/红色荧光胞质小泡，核呈绿色。

1.7Westernblot检测LC3Ⅰ/Ⅱ和p62蛋白的表达HepG2细胞分组培养48 h后，用预冷的PBS洗涤3遍，加入适量的含有蛋白酶抑制剂(PMSF，100 mmol/L)的RIPA裂解液，冰上裂解30 min， 12 000 r/min离心15 min(4℃)，取上清，加上样缓冲液混合后煮蛋白10 min，加样，电泳，用湿性转膜法将蛋白转移至PVDF膜上, 封闭液室温封闭3 h, LC3 Ⅰ/Ⅱ、p62抗体4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温作用1 h，化学发光液显影，采用Image Quant LAS 4000 mini 成像系统自动曝光。

1.8统计学处理采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析比较多组间资料，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1褪黑素对HepG2细胞内TG含量的影响与正常组HepG2细胞相比，油酸刺激后模型组HepG2细胞内TG含量明显升高，褪黑素1 μmol/L和10 μmol/L处理后，HepG2细胞内TG含量明显降低(图1)。

注：与正常组比较， *P<0.05； 与模型组比较， #P<0.05。

2.2油红O染色结果正常组HepG2细胞边缘清晰可见，细胞内无明显染色脂滴；模型组细胞内弥漫大量染色脂滴。褪黑素1 μmol/L组细胞内染色脂滴明显减少，表明褪黑素可改善HepG2细胞内脂滴的蓄积(图2)。

正常组 模型组 褪黑素1 μmol/L组

2.3褪黑素对HepG2细胞自噬的影响与模型组相比，褪黑素1 μmol/L组红色荧光强度/绿色荧光强度的比例明显增加(P<0.05)，表明褪黑素增加了细胞自噬水平(图3)。

2.4褪黑素对自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ和p62表达的影响与模型组比较，褪黑素1 μmol/L组LC3Ⅱ蛋白表达明显增加，p62蛋白的表达明显降低。提示褪黑素能够诱导保护性自噬的发生，从而缓解非酒精性脂肪肝。

注： 与正常组比较， #P<0.05； 与模型组比较， *P<0.05。

注： 与正常组比较， #P<0.05； 与模型组比较， *P<0.05。

3 讨论

褪黑素是松果体合成的一种神经内分泌激素，也是一种很强的抗氧化剂。褪黑素的保肝作用日益为人们所重视。实验表明褪黑素能够抑制氧化应激反应，减少还原型辅酶Ⅱ(NADPH)依赖的活性氧(ROS)产生[7]。

尽管NAFLD 发病进展较为缓慢，患者在短期内并无明显的肝功能损伤，但长期的 NAFLD会加重肝脏损害，可直接导致肝硬化，甚至是肝细胞癌。近年来，随着饮食条件的提高，生活方式的改变，脂肪类物质摄入较多，NAFLD 的发病率逐年上升，对人类健康的危害不断增加。因此，探索预防和治疗 NAFLD 的有效措施具有非常重要的意义。

越来越多的证据表明细胞自噬在慢性肝炎病毒感染、酒精性肝病和脂肪肝等各种类型的肝脏疾病的发生、发展中起到重要作用，成为关注和研究的新焦点[8-9]。自噬是一种普遍存在于真核细胞内的生理或病理过程，是调节蛋白质降解，促进细胞器更新，稳定细胞内环境的重要方式。在正常生理条件下，自噬水平一般是很低的,但当机体受到一些刺激(如饥饿、DNA损伤等)时，机体自噬水平就会明显升高[10-11]。自噬具有广泛的生理作用，包括为细胞提供能量、促进细胞器的更新、保护细胞免受氧化损伤以及维持细胞内稳态等多种作用。研究发现自噬可调节肝细胞内脂肪的分解代谢，并能有效维持细胞内能量的平衡，发挥保肝作用[12-13]。

LC3 是自噬泡形成过程中的一种关键蛋白，其以 2种形式存在于细胞中，即LC3-I和其蛋白水解衍生物 LC3Ⅱ。LC3Ⅰ主要分布在细胞胞浆内，LC3Ⅱ主要分布于自噬体双层膜上。一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3Ⅱ便被溶酶体中的水解酶降解，所以LC3Ⅱ 含量或 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值的变化反映了自噬活性的变化[14]。p62蛋白是自噬选择性降解蛋白，是自噬形成过程中的关键基因，代表了自噬活性。

本实验采用Western blot 法检测自噬相关蛋白 LC3和p62的表达水平，采用吖啶橙染色法检测了细胞自噬的水平，探讨了褪黑素对肝细胞自噬水平的影响。结果显示褪黑素可明显增加HepG2细胞自噬溶酶体的形成，增加 LC3蛋白的表达，减少p62的表达水平，同时降低HepG2细胞内脂滴的蓄积和TG的含量。结果提示，褪黑素通过调节自噬改善油酸诱导的HepG2细胞脂肪的蓄积。