王海娟，李春晓，王婷，张竞尧，南鹏，王劲松，张雪燕，林晨，钱海利

国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室，北京1000210

蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰的重要内 容，在酶和其他重要功能分子活性的发挥、第二信使传递和酶的级联反应中起重要作用。细胞内的许多蛋白通过磷酸化来行使DNA损伤修复、细胞凋亡、细胞周期阻滞等功能。蛋白质磷酸化网络精细调节细胞应对的各种应激过程，例如，当细胞暴露于紫外线损伤后，细胞内DNA损伤修复蛋白被磷酸化激活，修复DNA；细胞周期检验点蛋白被激活，细胞周期发生阻滞；如果DNA受损严重，有修复缺陷，细胞常通过p53依赖性凋亡发生凋亡[1-2]。p53是细胞应激反应过程中最经典的分子，多种基因毒性或非基因毒性应激信号可以使p53的N端或C端的不同位点发生磷酸化，修饰后的p53形成有生物学活性的四聚体，与靶基因上的p53反应元件结合，控制下游靶基因的表达，从而引起细胞生长阻滞、凋亡，或细胞适应DNA损伤而存活[3-4]。不同p53表达状态的细胞在受到紫外线照射后所发生磷酸化的蛋白不同，其发生的DNA损伤修复途径是否有差异还不甚清楚。为探讨p53野生型及p53缺失型的人结肠癌细胞经紫外线照射后磷酸化蛋白质组的表达差异，本研究将紫外线照射后的人结肠癌细胞系HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-的细胞总蛋白进行磷酸化蛋白质谱检测，将两组样品中重叠的差异表达磷酸化蛋白及特异的差异表达磷酸化蛋白分别进行基因本体论（gene ontology，GO）功能富集分析，继而用STRⅠNG数据库软件分析DNA损伤修复的蛋白互作网络，最后采用Reactome软件分别绘制HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-中DNA损伤修复通路，以期为阐明p53调控DNA损伤修复的机制提供线索。

1 材料与方法

1.1 细胞

本实验室保存的人结肠癌细胞系HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-采用含10%胎牛血清（购自Uruguay的Thermo Fisher Scientific公司）、100 U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素的DMEM培养基（购自北京细工生物科技有限公司）培养在37℃、5%CO2培养箱中。

1.2 细胞处理过程

将对数生长期的细胞接种在培养皿中，贴壁过夜后弃去培养基，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤3次，每次30 s，尽量吸干培养皿中残留的PBS，将培养皿置于紫外线灯下64 cm处照射30 s，相当于4.4 MJ/cm2强度。细胞重新加入培养基进行培养，4 h后提取总蛋白，同时提取未经紫外线照射的细胞总蛋白作为对照。采用磷酸化蛋白纯化试剂盒PhosphoProtein Purification Ki（t购自美国QiagenⅠnc公司）分离、浓缩、纯化磷酸化蛋白。

1.3 蛋白质谱检测样品信息

样本：a.HCT116 p53-/-0 min；b.HCT116 p53-/-4 h；c.HCT116 p53+/+0 min；d.HCT116 p53+/+4 h。将每个样品不少于200 ug磷酸化蛋白送至上海中科新生命科技有限公司进行结肠癌细胞磷酸化蛋白质组学质谱分析。

1.4 统计学分析

首先对质谱原始数据的蛋白ⅠD进行转换，并将样本间的数据标准化，然后分别比较样品a、b之间及样品c、d之间的差异表达蛋白，并对两组结果进行一致性分析。将两组共同的差异表达磷酸化蛋白与不同的差异表达磷酸化蛋白分别进行GO富集分析，然后用STRⅠNG数据库软件分析DNA损伤修复相关的差异表达磷酸化蛋白的互作网络，最后采用Reactome软件分别绘制HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-细胞中DNA损伤修复通路。

2 结果

2.1 紫外线照射前后HCT116 p53+/+和HCT116 p 53-/-细胞中差异表达的磷酸化蛋白

在所检测到的301个磷酸化蛋白中，HCT116p53-/-在紫外线照射前后差异表达的磷酸化蛋白有210个，HCT116 p53+/+在紫外线照射前后差异表达的磷酸化蛋白有148个，仅在HCT116 p53+/+中发生差异表达的磷酸化蛋白有91个，仅在HCT116 p53-/-中发生差异表达的磷酸化蛋白有153个。HCT116 p53-/-与HCT116 p53+/+差异表达的磷酸化蛋白中有57个重叠，其中表达上调或下调趋势一致的磷酸化蛋白有39个，这些共同的差异磷酸化蛋白分别是AKAP12、ATF2、HCFC1、HN1、TJP3、KⅠ-AA1429、NUP153、PGRMC1、SEC22B、STMN1、C11orf84、CD44、EPHA2、FOXK2、HSF1、HSPB1、MED12、MKⅠ67ⅠP、RBM25、RRP1B、SMARCD2、TPR、TMPO、C17orf85、DKC1、CDC2L2、MTA1、MYH9、 SRRM2、 MDC1、 MED13L、 SRRM1、NOP56、NCOR2、NUP210、RPS3、SGPP1、NUMA1和RBM39。

2.2 紫外线照射后 p53表达状态不同的HCT116细胞中的磷酸化蛋白的功能富集

为阐明紫外线照射后依赖p53及不依赖p53的磷酸化蛋白的功能，本研究首先对HCT116 p53-/-与HCT116 p53+/+两组差异表达的磷酸化蛋白中交叉的表达趋势一致的39个蛋白进行了GO功能富集分析，发现无论p53野生型还是p53缺失型HCT116细胞，在紫外线照射后，表达明显改变的磷酸化蛋白功能均富集在非编码RNA加工、大分子加工、mRNA加工、细胞周期调控等方面（图1）。

在p53表达缺失的HCT116细胞中，紫外线照射后特异的差异表达的磷酸化蛋白功能主要富集在mRNA加工、转录调控、细胞黏附、DNA解螺旋等方面；而在p53野生型的HCT116细胞中，紫外线照射后特异的差异表达的磷酸化蛋白功能主要富集在染色质修复与组蛋白修饰、DNA损伤修复、蛋白质泛素化修饰、转录调控等方面（图2）。

图1 紫外线照射后 p53表达状态不同的HCT116细胞中共同的差异表达的磷酸化蛋白功能富集分析

2.3 紫外线照射后 p53表达状态不同的HCT116细胞DNA损伤修复的通路网络

为进一步分析紫外线照射后p53表达状态不同的HCT116细胞DNA损伤修复通路的差异，本研究将两种细胞中紫外线照射前后差异表达的DNA损伤修复相关的磷酸化蛋白录入STRⅠNG数据库中，对两组中重复出现的磷酸化蛋白进行去重处理，绘制蛋白互作网络图，最后采用Reactome软件分别绘制HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-细胞中DNA损伤修复通路。HCT116 p53+/+细胞在紫外线照射后特异磷酸化的DNA损伤修复相关蛋白主要有DDB2、YY1和SMARCA5，主要参与全基因组核苷酸切除修复的DNA损伤识别（DNA damage recognition in GG-NER）。HCT116 p53-/-细胞在紫外线照射后特异磷酸化的DNA损伤修复相关蛋白为NBN、TP53BP1、MDC1，主要参与非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）。两种细胞中共同表达的差异磷酸化蛋白有CD44、RPS3、EPHA2、ATF2和TPR（图3）。由此可见，在p53表达正常的情况下，紫外线导致的胸腺嘧啶二聚体会立即磷酸化DDB2、YY1等蛋白，识别DNA损伤位点，细胞进行全基因组核苷酸切除修复。而在p53表达缺失的情况下，紫外线照射有可能导致更严重的DNA损伤，细胞中NBN、TP53BP1、MDC1蛋白磷酸化，参与的DNA损伤修复通路主要为NHEJ。这个过程有可能造成基因组的片段缺失，导致细胞的基因组不稳定（图4）。

图2 紫外线照射后 p53表达状态不同的HCT116细胞中特异的差异表达的磷酸化蛋白功能富集分析

图3 DNA损伤修复相关磷酸化蛋白的互作网络

图4 p53表达状态不同的HCT116细胞中磷酸化蛋白参与的DNA损伤修复通路

3 讨论

蛋白磷酸化/去磷酸化普遍存在于各种细胞活动过程中，调节蛋白的活性或生物学功能。磷酸化激酶包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶两大类，它不仅通过影响许多生化酶的活性而参与糖、脂肪和蛋白质等物质代谢，而且参与各种信号传递，影响转录因子活性及其核转位，调节靶基因的转录激活。本研究结果表明p53野生型的结肠癌细胞HCT116在紫外线照射前后有148个磷酸化蛋白的表达水平发生明显改变，而p53表达缺失的细胞中有210个差异表达的磷酸化蛋白。这提示在野生型p53存在的情况下细胞受到紫外线照射后磷酸化状态的改变更有秩序，显著改变的磷酸化蛋白数目少，组蛋白和其他蛋白有组织地出现泛素化等修饰。

多种因素导致的DNA损伤在修复过程中也离不开蛋白质的磷酸化，DNA修复是细胞保护基因组完整性的一个重要功能系统，机体DNA修复能力的降低与肿瘤的发生密切相关。本研究发现在p53野生型的结肠癌HCT116细胞中，紫外线照射后细胞产生快速的应激调控，DDB2、YY1及SMARCA5磷酸化水平明显改变。有研究表明，内源性YY1的失活增强了p53的积累以及p53靶基因在DNA损伤中的表达，并且YY1的失活使细胞对DNA损伤诱导的细胞凋亡更敏感。YY1可能是p53对基因毒性应激反应的重要负调节因子[5]。DDB2最初被鉴定为核苷酸切除修复中的DNA损伤识别因子，其参与紫外线诱导的DNA损伤的修复[6]。在全基因组核苷酸切除修复（global genome nucleotide excision repair，GG-NER）过程中，DDB2对基因组转录失活区域以及非转录链的修复应答发挥重要的功能。有研究表明，DDB2通过阻滞Wnt信号通路从而抑制结肠癌的发展[7]，而且其在非小细胞肺癌中的表达可以作为预测患者放射敏感性的生物标志物[8]。SMARCA5不仅是SMARC基因亚家族的一员，而且还是染色质重塑的ATPase亚单位。在DNA发生损伤时，SMARCA5被募集到DNA损伤位点，促进DNA损伤修复[9]。

在p53表达缺失的情况下，紫外线照射不仅导致嘧啶二聚体产生，细胞还可能发生更严重的DNA损伤。本研究表明，在p53表达缺失的结肠癌HCT116细胞中，紫外线照射后TP53BP1、MDC1和NBN的磷酸化水平明显改变，这些差异表达的磷酸化蛋白参与的DNA损伤修复通路主要为NHEJ。NHEJ是真核生物细胞在不依赖DNA同源性的情况下，为了避免DNA或染色体断裂导致的DNA降解或对细胞存活的影响，将两个DNA断端强行连接在一起的DNA双链断裂修复机制。TP53BP1被称为DNA损伤反应的介质和DNA双链断裂（DNA double-strand break，DSB）修复的调节剂[10]。MDC1蛋白是DNA损伤后检查点激活和后续DNA修复的核心参与者。磷酸化MDC1在不依赖于DNA损伤应答途径的基因组稳定的维持性中也发挥着至关重要的作用[11]。组蛋白伴侣抗沉默 因 子1a（anti-silencing function 1a，ASF1a）与MDC1相互作用并被募集到DNA双链断裂位点以促进磷酸化的ATM与MDC1的相互作用以及MDC1的磷酸化，促进NHEJ，使细胞对DNA双链断裂更耐受[12]。ATM蛋白激酶是哺乳动物细胞中DNA双链断裂反应的核心。细胞经射线照射后，二聚体ATM在Ser 1981处经历自磷酸化并解离成活性单体。有研究表明nibrin通过与ATM相互作用促使ATM活化[13]。

p53在DNA损伤修复中发挥重要作用，但有一些DNA损伤修复蛋白的磷酸化不依赖于p53，本研究发现RPS3、EPHA2、TPR、ATF2和CD44的磷酸化水平在紫外线照射HCT116 p53-/-与HCT116 p53+/+两组细胞后均发生明显改变，提示这些蛋白的磷酸化广泛参与DNA损伤修复，且不受p53影响。RPS3作为40S核糖体亚基的组分参与翻译过程及DNA损伤的加工，起到损伤DNA核酸内切酶的作用。有研究表明，RPS3的核积累导致DNA修复活性在一定程度上增加，从而维持神经元的存活状态。减弱AKT介导的RPS3磷酸化可加速凋亡细胞的死亡并严重损害RPS3的核转位[14]。EPHA2在野生型和突变型p53的小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）中均可激活细胞凋亡程序，并且可被caspase 8抑制剂阻断[15]。在黑色素瘤细胞中敲降ATR可显著降低活性转录因子-2（ATF2）的磷酸化水平，并提高存活基因Sox10的表达，导致黑色素瘤细胞死亡所需的DNA损伤应答阈值显著提高[16]。CD44是一种糖蛋白，当细胞DNA损伤时，CD44可以稳定ERBB2并共激活p-p38表达，然后通过同源重组（homologous recombination，HR）途径促进DNA损伤修复，最终有助于提高细胞对放射治疗的抗性[17]。

综上所述，p53在紫外线照射诱导的蛋白磷酸化中发挥重要作用，p53状态不同的HCT116细胞经紫外线照射后发生的DNA损伤修复途径有可能不同。