邵采凤，张雯玮，胡朝婷，王冉超，接 玉，赵昶昀，陈 茜，杨 鲲

(1. 江苏大学医学院解剖学教研室，江苏 镇江 212013; 2. 江苏大学附属人民医院麻醉科，江苏 镇江 212002; 3. 江苏大学医学院2015年级本科生，江苏 镇江 212013; 4. 江苏大学医学院2016年级本科生，江苏 镇江 212013)

中脑导水管周围灰质 (periaqueductal gray, PAG) 在伤害性信息的下行抑制系统中处于至关重要的位置[1]。PAG的腹外侧 (ventrolateral PAG, vlPAG) 亚区是参与伤害性信息调制的重要区域。PAG发出的纤维终止于脊髓背角，参与脊髓水平伤害性信息的调制，PAG的研究重点集中在其vlPAG亚区[1-2]。

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid, GABA) 是PAG内重要的抑制性神经递质[2]。GABA能突触分泌的GABA与突触后GABA受体结合，后者包括GABAA受体和GABAB受体[1]。同时，谷氨酸是最重要的兴奋性神经递质。谷氨酸能突触分泌的谷氨酸与突触后谷氨酸受体结合，后者包括NMDA受体[3]和AMPA受体。由于GABAB受体既表达在谷氨酸能突触终末，也表达于GABA能突触终末上，因此，从理论上推断，GABAB受体激动剂可以激活这些受体，并抑制GABA能及谷氨酸能突触[4-6]，继而抑制GABA和谷氨酸的释放。前期的实验结果也印证了这个推断[7-10]。

虽然GABAB受体被激活后，在神经系统内普遍引起“抑制效应”，但是研究人员很早就注意到，不同浓度的GABAB受体激动剂在PAG发挥的作用不同，继而通过影响下行抑制系统，产生“镇痛”与“致痛”作用[2,11]。这些结果提示不同浓度的GABAB受体激动剂可能在PAG内对兴奋性突触和抑制性突触有影响，继而打破动态平衡而影响PAG的输出，最终造成对脊髓水平的伤害性信息调制的不同作用[7]。本实验试图用“饱和浓度”及“非饱和浓度”的GABAB受体激动剂巴氯芬分别激活PAG内的谷氨酸能突触及GABA能突触，比较不同浓度的巴氯芬对上述两类突触的作用。根据已知的GABAB受体激动剂的药代动力学特征，本实验使用的“饱和浓度”和“非饱和浓度”的巴氯芬的浓度分别确定为5 μmol·L-1和 0.1 μmol·L-1[12]。最后，比较两种浓度对单个PAG细胞兴奋性的“净作用”(net effects)，以探讨不同浓度GABAB受体激动剂引起不同作用的机制。

1 材料与方法

1.1试剂巴氯芬和EGTA购自美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯，购自中国上海国药化学试剂公司。

溶液配制：① 人工脑脊液 (mmol·L-1，pH 7.2，渗透压约305 mOsm): NaCl 124、KCl 2.6、CaCl22.5、NaH2PO41.2、MgCl21.2、NaHCO325、葡萄糖 11。② 脑薄片切片液 (mmol·L-1，pH 7.2):蔗糖 212.7、KCl 4、CaCl20.5、NaH2PO41.23、MgCl210、NaHCO326、葡萄糖10。③ 记录电极内液1(pH 7.2，由CsOH调节, 渗透压约290 mOsm)，记录抑制性突触后电流 (mmol·L-1): 甲基硫酸铯 85、CsCl 50、HEPES 10、MgCl22.5、Na2-ATP 4、Na3-GTP 0.4、Na-phosphocreatine 10、EGTA 0.6。④ 记录电极内液2(pH 7.2，由KOH调节, 渗透压约290 mOsm)，记录兴奋性突触后电流 (mmol·L-1): K-gluconate 135、KCl 5、CaCl20.5、MgCl22、EGTA 5、HEPES 5、Mg-ATP 3.6。

1.2实验动物6～8周龄 ♂ Sprague-Dawley (SD) 大鼠，购自江苏大学实验动物中心，实验许可证号为SCXK (苏) 2013-0011。本实验有关使用动物的程序均经江苏大学实验动物伦理委员会批准，符合相关伦理规范。

1.3PAG脑片的制作PAG脑片的制作方法参见文献[7-9]，异氟醚吸入将大鼠深度麻醉，于第2颈椎水平迅速断头；沿颅正中线剪开大鼠头部皮肤，暴露颅骨，以尖嘴骨剪从椎孔向上沿颅骨矢状缝向前剪开至双眼连线位置，小心剥开切除颅骨，暴露鼠脑，以专用刮刀剥离全脑(包括大脑、中脑、小脑和部分脑干)。浸入用混合气体(95% O2+5% CO2)充盈饱和的冰冷的人工脑脊液中；在解剖显微镜(江西上饶凤凰光学仪器公司)下，仔细修剪大脑，用手术刀修去多余部分，得到1个包含中脑的脑块；将脑块轻贴附于琼脂块上，用速干胶将琼脂块黏于7000smz-2 振动切片机(英国Campden Instruments公司)载物台上，横切薄片厚度设定为350 μm，振动频率为80 Hz，刀片前进速度为0.1 mm·s-1；将横切的包含PAG的中脑薄片放在约36 ℃的人工脑脊液中孵育30 min, 再转移到室温 22～24 ℃人工脑脊液中保存备用。全程液体均由上述混合气体充盈，以维持必要的酸碱度和氧气浓度。

1.4全细胞记录在室温条件下，将1枚切片移至记录槽中，维持人工脑脊液灌注，速率6～8 mL·min-1。低倍镜下选取PAG薄片的腹外侧部分，再将高倍镜置于该区域，使用BX51WI相差显微镜(日本Olympus公司)配合红外水浸镜头在明视野下采集图像，并连接至监视器，观察神经元，选取“健康饱满”的PAG细胞准备记录。

P-97微电极拉制仪(美国Sutter Instrument公司)将玻璃毛坯拉制成尖端约1 μm的记录电极，由电极后端充以电极内液。从电极后端给予适当大小正压，防止尖端堵塞。电极尖端进入液体后，电阻约为4～6 MΩ。使用微操纵器移动电极，使其尖端移动至选定的神经元细胞膜表面，并形成“酒窝”后，释放正压，改为适当负压吸引细胞，形成“巨欧姆”封接(电阻>1 GΩ)，对电极内施加连续的短暂负压，使电极尖端吸住的细胞膜破裂，电极内液与细胞内部相接，建立“全细胞记录模式”[9,13]。

在电压钳模式下，设置钳制电压为-70 mV。当电极内充以Cs+内液(电极内液1)，可记录到抑制性突触后电流(inhibitory postsynaptic currents, IPSCs)；当电极内液为K+内液(电极内液2)，可记录到兴奋性突触后电流 (excitatory postsynaptic currents, EPSCs) 。在电流钳模式下，使用电极内液2且钳制电流保持在0 pA时，可以记录到突触前同心圆电极刺激引起的突触后电位(postsynaptic potentials, PSPs)[13]。所有信号都通过Axopatch 200B微电极放大器放大，经由Axon Digidata 1550数模转换器(均购自美国Molecular Devices公司)转换信号，滤波频率为5 kHz，采样频率为10 kHz。通过在电脑上运行的pClamp 10.2记录软件(美国Molecular Devices公司)记录，或用此软件通过数模转换器的数字输出，再经隔离器(Stimulus Isolator A395, 美国WPI公司)给予突触前刺激。

2 结果

2.1 “非饱和浓度”的巴氯芬对GABA能突触和谷氨酸能突触的作用本部分所有实验均在室温下进行，因此，本实验结果反映的是室温下GABAB受体的反应。首先，我们观察了“非饱和浓度”的GABAB受体激动剂巴氯芬对GABA能突触和谷氨酸能突触的作用。0.1 μmol·L-1的非饱和巴氯芬灌流后，可将同心圆电极刺激引起的兴奋性突触后电流 (evoked EPSCs, eEPSCs) 的幅度由对照组的(106±10)pA降低到(89±11)pA (n=11,P<0.01)。同样浓度的巴氯芬将同心圆电极刺激引起的抑制性突触后电流 (evoked IPSCs, eIPSCs) 的幅度由对照组的(142.4±20)pA降低到(103±5)pA (n=10,P<0.01)。即0.1 μmol·L-1的巴氯芬对兴奋性突触后电流eEPSCs的抑制率为(14±3)%，而对抑制性突触后电流eIPSCs的抑制率为(26±4)%，两个抑制比率差异有统计学意义(P=0.038),见Fig 1A、1B。提示低浓度巴氯芬抑制更多的抑制性突触传递。

2.2 “饱和浓度”的巴氯芬对GABA能突触和谷氨酸能突触的作用其次，我们研究了5 μmol·L-1的“饱和浓度”巴氯芬的作用。将同心圆电极刺激引起的兴奋性突触后电流eEPSCs的幅度由对照组的(106±10)pA降低到(19±3)pA (n=11,P<0.01)。同样浓度的巴氯芬将同心圆电极刺激引起的抑制性突触后电流eIPSCs的幅度由对照组的(142±20)pA降低到(33±7)pA (n=10,P<0.01)。平均每个神经元的实验结果，5 μmol·L-1的巴氯芬对兴奋性突触后电流eEPSCs的抑制率为(80±3)%，对抑制性突触后电流eIPSCs的抑制率为(83±3)%，两个抑制比率差异无统计学意义(P>0.05) 。见Fig 1C。

2.3 “饱和浓度”及“非饱和浓度”的巴氯芬对单个PAG细胞兴奋性的“净作用” 上述实验表明，0.1 μmol·L-1的巴氯芬对兴奋性突触和抑制性突触有不同比例的抑制作用，结果提示，该浓度下的巴氯芬“净作用”可能有兴奋性增加或兴奋性降低两种。最后，为了阐明上述问题，我们研究了单个神经元的兴奋性。形成全细胞记录模式后，对单个PAG神经元进行电流钳制，通过记录电极使得电流始终保持为0，此时可以记录到刺激引起的突触后电位PSPs[7]。如Fig 2所示，突触前刺激电极给予适量的刺激强度可以记录到突触后电位PSPs，给予饱和浓度的巴氯芬(5 μmol·L-1)将动作PSPs的数值由(3.65±0.25)ms·mV降低到(1.53± 0.21)ms·mV (P<0.01)，巴氯芬洗脱后频率恢复到对照组水平(3.53±0.32)ms·mV。而“非饱和浓度”的巴氯芬 (0.1 μmol·L-1) 将突触后电位PSPs提高到(15.30±2.51)ms·mV，在多数神经元还可能引起动作电位爆发 (Fig 2A4)。

Fig 1 Non-saturated concentration and saturated concentration GABAB receptor agonist baclofen inhibited both eIPSCs and eEPSCs

Baclofen at 0.1 μmol·L-1depressed the amplitude of eIPSCs (A) and eEPSCs (B) and at the concentration of 5 μmol·L-1, the amplitudes were largely depressed. The dashed line indicated the peak amplitude of either eIPSCs or eEPSCs. The pooled data showed that at 5 μmol·L-1baclofen inhibited the amplitudes of eIPSCs and eEPSCs with the same ratio, while at 0.1 μmol·L-1, it depressed with different ratios (C).**P<0.01vseIPSCs.

净作用表示为突触后电位PSPs的AUC，AUC提高代表巴氯芬对突触的影响增加，AUC降低代表对突触的作用降低。以上结果提示，“非饱和浓度”的GABAB受体激动剂对PAG神经元的兴奋性具有提高作用 (Fig 2B)。

3 讨论

GABA是PAG内最重要的抑制性递质，GABAB受体也是重要的调节PAG在下行抑制系统功能的受体[1,5]，因为GABAB受体既能抑制兴奋性突触，从而降低PAG神经元的兴奋性，又能抑制抑制性突触，从而增加神经元的兴奋性。因此，GABAB受体的作用十分复杂，而其对兴奋性突触和抑制性突触的“净作用”决定了GABAB受体对PAG输出的调节状态，即如果巴氯芬的净作用是降低了PAG神经元的兴奋性，则降低了下行抑制系统的输出；反之，如果其作用是增强了PAG神经元的兴奋性，则增强了下行抑制系统的输出[7]。

Fig 2 Saturated and non-saturated GABAB receptor agonist baclofen showed different actions on excitability of PAG neuron

A: Presynaptic stimulation-induced PSPs AUC was depressed by saturated concentration of baclofen (5 μmol·L-1), but the excitability was elevated by non-saturated baclofen (0.1 μmol·L-1). Baclofen at 0.1 μmol·L-1increased PSPs and even in some cases action potential occurred (A4). B: Pooled data showed that 5 μmol·L-1baclofen depressed AUC, but this depression was recovered after washout, while 0.1 μmol·L-1baclofen increased AUC. Wash: washout.**P<0.01vscontrol.

这两种结果都影响到自PAG起的下行抑制系统的环路[1-2]。因为PAG的投射有经中缝系统的延髓吻段腹侧部再向脊髓背角投射，也有直接终止于脊髓背角[1-2]。无论是PAG内巴氯芬微量注射[11]，还是鞘内给予巴氯芬[14]，都能影响实验动物的痛行为学反应，这些可能都是通过GABAB受体的抑制作用和脱抑制作用实现对痛反应的调节。本实验中，我们在突触水平获得的直接证据表明，低浓度的巴氯芬引起了神经元的兴奋作用，这个因素可能是PAG水平GABAB受体引起脊髓水平镇痛效应的基础之一。因为GABA受体在中枢神经系统有复杂的功能[4-5,15]，但巴氯芬在PAG内的作用最终引起脊髓水平的伤害性信息调制结果的解释，还需进一步实验验证[7]。

值得强调的是，因为巴氯芬既能降低兴奋性谷氨酸的释放，降低突触后神经元的兴奋性，同时也能降低GABA的释放，继而通过“去抑制”的方式增加兴奋性，因此某浓度下的巴氯芬净作用可能有兴奋性增加或兴奋性降低两种。为了判断“净作用”是兴奋或抑制，我们在不加谷氨酸受体抑制剂或GABAB受体抑制剂的条件下，记录突触后综合电位PSPs。我们判断净作用的方式是以基线延长线为界，线上面积增加，表示兴奋性增加；线下面积增加，则表示抑制性作用增加。因为兴奋性和抑制性同一时间轴上可以相互抵消，且本实验中主要面积分布在基线延长线以上，因此主要巴氯芬的净作用是对兴奋性的作用。此方法为电生理常用计算方法之一[7]。

需要指出的是，GABAB受体激动剂与受体的结合，与其他受体类似，也有温度依赖性。本实验是在离体薄片室温进行，其实际药代动力学与体温可能存在差别。因此，为了探讨巴氯芬的作用，还需进一步验证其在生理温度(约36 ℃)的作用[16]。另外，GABAB受体及阿片μ受体都是下行抑制系统里的与胞内G蛋白偶联的受体，激活它们可能产生复杂的抑制及脱抑制作用[7,16]。我们当前的实验结果和前人的部分结果类似，其最终机制可能与受体激动剂的浓度等相关。

(致谢：本实验在江苏大学基础医学院解剖教研室实验室完成，感谢解剖教研室姜平教授、欧阳琦副教授的指导及杨鲲实验室同仁的帮助。)