雷晓庆, 吴兰兰, 王文娟, 林冬枝,2, 董彦君,2*

(1.上海师范大学 生命与环境科学学院,上海 200234; 2.上海师范大学 遗传研究所,上海 200234)

0 引 言

水稻的栽培历史悠久,中国约有一半人口以水稻为主食[1],因此研究如何提高水稻的产量来解决日益严峻的粮食问题非常重要.水稻经光合作用进行干物质积累,叶绿体在很大程度上决定了光合作用的效率[2].叶绿体是植物进行光合作用的场所,是半自主性细胞器[3],由叶片分生组织细胞中的前质体在相关的核、质基因共同调控下生成[4-6].自然或非自然因素都会导致与叶绿素合成或叶绿体发育相关的基因发生突变,造成叶绿素合成或降解受阻,叶绿体发育缺陷,最终引起叶色的变化,甚至导致整个植株死亡[7].已知水稻的一些白化突变体从发芽至三叶期均呈白化表型,最终无法光合作用而死亡,相关的基因也得到了初步的定位.程世超等[8]报道的水稻白化致死突变体abl4的突变基因位于第4染色体;余庆波等[9]将水稻白化致死突变体alb21的突变基因定位在第3染色体,并发现其叶绿体中只有一些空泡状结构;朱环环等[10]将水稻白化致死突变体abl25,定位于第2染色体;夏久成等[11]将一个返绿的白化突变基因al12,定位在第8 染色体上;潘江杰等[12]通过对白化致死突变体ABD研究,将ABD基因定位在第7染色体,发现一个关于类胡萝卜素相关基因编码区上的G变成了A,氨基酸从野生型P(脯氨酸)突变成了L(亮氨酸),导致突变体表型白化.另外,本实验室也报道了4个水稻白化突变基因asl1,asl2,asl3 和asl4,其中asl1[13]和asl2[14]是核糖体白蛋白编码基因突变引起,asl3是编码三角状五肽重复结构域(Pentatricopeptide repeat,PPR)蛋白基因突变引起[15],白化致死突变体asl4,定位于第2染色体[16].本研究发现并鉴定了一个水稻苗期白化致死突变体asl6(albinoseedlinglethality6),其表型不受温度影响;对其叶色、叶绿素含量、叶绿体超微结构进行观察分析,并利用简单重复序列(SSR)及InDel 分子标记对该突变基因进行了定位,为该基因的分子克隆及其作用机理的研究奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材 料

突变体asl6从粳稻“嘉花1号”干种子经60Coγ射线辐照后代获得.“嘉花1号”干种子经过辐照之后,突变体进行自交选取苗期分离出白化表型的株系(上一代为杂合单株),随机选取生长正常的单株挂牌,收获挂牌的单株种子播种,根据后代分离情况确定上一代的基因型,弃纯合野生型单株,保留杂合单株.

1.2 方 法

1.2.1 突变体的表型观察

为了进一步确定突变体asl6的表型,将突变体杂合子及其野生(WT)型“嘉花1号”的种子在32 ℃条件下催芽3 d后,分别播种在装有水稻土的塑料盆内,因为有很多温敏感的突变体被报道,为排除这种温度差异,将它们分别放置在25 ℃和32 ℃的光照培养箱(GXZ智能型)内,模拟水稻生长的自然条件,每日光照12 h,光照强度为180 μmol·m-2·s-1,适时观察幼苗叶色变化,并对其进行拍照.

1.2.2 叶片光合色素含量的测定

突变体asl6与野生型“嘉花1号”长至三叶期时,按张宪政的方法[17]测定其叶片光合色素含量.具体为取野生型“嘉花1号”和突变体的三叶期的叶片,剪其第三叶片中间区域,称取20 mg,将其剪碎,并放入5 mL的离心管中,加5 mL叶绿素提取液(体积比:V乙醇∶V丙酮∶V水=5∶4∶1)并轻轻摇匀,将其放置在室温、黑暗的环境中处理18 h,直到叶片的绿色全部溶解到提取液中.利用METASH-UV5100分光光度计分别测定470 nm(叶绿素a最高吸收波长)、645 nm(叶绿素b最高吸收波长)、663 nm(叶绿素类胡萝卜素最高吸收波长)波长下的吸光值,重复3次,取其均值.

1.2.3 叶绿体显微结构观察

叶片取样与上述相同叶片,随后延叶脉方向剪成面积为1 mm2的小正方形,立即放入2.5%(质量分数)戊二醛固定液(V1∶V2∶V3=1∶4∶5,V1,V2,V3分别为质量分数为2.5%的戊二醛,浓度为0.2 mol·L-1的磷酸缓冲液和无菌水)中,24 h后换新鲜固定液,4 ℃保存.固定之后,进行清洗、再固定、洗涤、脱水与硬化、置换、浸渍、包埋、聚合、修块、切片、染色等一系列处理,再用透射电镜(Hitachi765型)进行观察拍照.

1.2.4 遗传分析和定位群体的构建

突变体杂合子与“培矮64S”杂交获得F1种子,收获单株种子播种,根据后代分离情况确定上一代的基因型,只保留杂合基因型,自交获得能用于遗传分析F2代群体,选取表现为白化表型的单株用于初定位.

1.2.5 水稻DNA的提取

采用TPS (tris physiological saline) 法[18]以及十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[19],提取亲本以及F2代遗传群体基因组 DNA.

1.2.6 基因定位

本研究中,首先利用本实验室筛选的“嘉花1号”和“培矮64S”多态性DNA分子标记,随机挑选F2中分离出的22株突变表型白化苗作连锁分析,确定突变基因在哪条染色体上,然后,进一步扩大F2群体进行基因定位,并应用 MAPMAKER/EXP 3.0软件,构建目的基因区域的遗传图谱.在目标区域内通过NCBI公布的粳稻日本晴和籼稻9311基因组序列的InDel位点,利用Primer Premier 5.0 软件设计引物(表1).经聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)产物用2.5%～3.0% (体积分数)的琼脂糖凝胶电泳检测,经溴化乙锭染色后在紫外线凝胶成像仪上成像,而对于多态性不明显的引物的 PCR 产物,用8% (体积分数)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,银染之后观察拍照记录.

表1 用于基因定位的引物序列

1.2.7 叶绿体相关基因的实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析

分别取野生型“嘉花1号”和突变体asl6植株的三叶期叶片,提取其RNA,并反转为cDNA(RNA提取及反转录试剂盒分别购自全式金的TransZol Plant和TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix).利用qRT-PCR对叶绿体发育和叶绿素合成相关基因(引物序列如表2所示)进行RNA水平的表达量的分析(SYBR Green Realtime PCR Mix试剂盒购自东洋纺公司),实验操作按照说明书进行,用到的仪器为ABI7500.

表2 用于qRT-PCR分析的引物序列

2 结果与分析

2.1 突变体的表型

图1 野生型“嘉花1号”和突变体asl6植株生长各时期表型变化

在 25 ℃和32 ℃人工气候箱条件下对突变体asl6和野生型“嘉花1号”植株苗期叶色表型进行观察,突变体asl6发芽后长出的叶鞘、不完全叶以及第2、3片真叶都为白色,到四叶期突变体逐渐死亡(图1),这表明该突变体叶色变化不受温度影响,属于水稻苗期白化致死突变.

2.2 突变体的光合色素含量变化

测定了野生型“嘉花1号”与突变体asl6的叶绿素及类胡萝卜素含量,与野生型相比,该突变体叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量几乎为零(图2).由此可知,光合色素合成和积累受影响会导致植株苗期呈白化表型.

图2 野生型“嘉花1号”和突变体asl6植株三叶期叶片光合色素含量

2.3 突变体叶绿体显微结构

图3 (a),(b) 野生型“嘉花1号”和(c),(d) asl6植株叶绿体显微结构图(箭头标记为叶绿体)

通过观察野生型“嘉花1号”与突变体asl6的叶绿体超微结构发现:野生型叶绿体内部存在完整清晰的类囊体片层结构,如图3(a),3(b)所示;而突变体中观察不到一个完整的叶绿体并且含有较多空泡,如图3(c),3(d)所示.这说明该突变体的叶绿体发育受到影响,导致没有正常的叶绿体,从而产生白化表型.

2.4 遗传分析

2.5 基因定位

选取22株F2代白化苗进行连锁分析,发现水稻第2染色体上的分子标记RM525(图4)有强烈的偏态扩增,因此,判断asl6位于第2号染色体上.然后扩大群体至2560株,如图5(A)所示,将该基因定位在分子标记ID30471与ID32344之间,其遗传距离分别为2.3 cM 和3.2 cM.为了进一步定位目标基因区域,定位群体扩大至4982株,将突变基因定位在ID31982与MM5712之间,物理距离约为293 kb,如图5(B)所示.该区间跨越水稻日本晴基因组AP004159.3与AP004187.3之间的多个BAC克隆群(http://rice.plantbiology.msu.edu).

图4 分子标记RM525在亲本P1、P2及22株具有突变表型F2代单株的DNA分离带型.P1:嘉花1号;P2:培矮64S

2.6 叶绿体相关基因的qRT-PCR分析

通过实时定量PCR来探究突变体asl6中与叶绿素合成、光合作用以及叶绿体发育相关基因的表达量.结果显示:突变体中编码原叶绿素酸脂氧化还原酶基因PORA等叶绿素合成的相关基因的表达量下调,如图6(a)所示;psaA、psaB、psbA分别为光系统Ⅰ反应中心蛋白A、光系统Ⅰ反应中心蛋白B、光系统Ⅱ反应中心蛋白A,这些与光合作用相关的基因的表达量明显下调,如图6(b)所示.优先被nucleus-encoded RNA polymerase (NEP)转录的plastid-encoded RNA polymerase (PEP)核心亚基a、β、β′基因rpoA、rpoB、rpoC1等与叶绿体发育相关的基因的表达量也呈下调趋势;而编码核苷酸还原酶的大、小亚基RNRL、RNRS的表达量下调很小(图7).这一结果与突变体苗期白化致死现象相吻合,表明asl6基因的突变影响了突变体中的与叶绿素合成、叶绿体发育以及光合作用相关的基因的表达,从而导致植株死亡.

图6 突变体中与叶绿素合成(a)和 光合作用(b)相关的基因的表达分析

图7 突变体中与叶绿体发育相关的基因的表达分析

3 讨 论

叶绿体为半自主性细胞器,有120个基因[20],而这些基因只负责叶绿体内大约5%的蛋白,因此叶绿体的正常运作还需要细胞核基因的参与.当细胞核内基因发生突变时,均有可能影响叶绿体的正常发育.目前,水稻中已经有超过70种叶绿素/叶绿体缺陷突变体[21].本研究中通过测定叶绿素含量发现:突变体asl6的叶绿素含量几乎为零;透射电镜观察不到一个完整的叶绿体且含有较多空泡;经qRT-PCR分析可知突变体中与叶绿素合成、叶绿体发育、光合作用相关的基因的表达量明显下调.该结果与突变体幼苗期呈白化致死的现象相符合.而叶绿体发育早期相关质体分裂基因(FtsZ)和编码核苷酸还原酶大小亚基(RNRL、RNRS)的表达量变化不大(图7),说明ASL6基因可能参与调控叶绿体后期发育相关的基因.

本实验在基因定位过程中,采用4982个单株F2分离群体,将该基因定位于第2号染色体的InDel分子标记ID31982与SSR分子标记MM5712之间约293 kb的区域内.通过生物信息学预测发现,该区间有33个有功能编码蛋白的候选基因,11个未知功能表达的蛋白基因.通过水稻网站预测(http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/request.ep) 发现了在叶绿体中高表达,且与叶绿体发育相关的基因LOC_Os02g52470、LOC_Os02g52650、LOC_Os02g52744,对其测序发现其与野生型基因组序列没有差异,这说明上述3个候选基因可能与突变体asl6白化致死无关.目前,在已锁定的293 kb目标区间内,还没有相关水稻叶色突变基因被报道.因此,asl6突变基因可能是一个新的叶色白化致死突变基因.今后,将在此基础上扩大定位群体,发展更多新的分子标记,对该基因进行克隆和功能分析,这也将有助于更进一步了解水稻叶绿体发育分子的作用机理.