胡美忠， 邬小兰， 郁建生

（铜仁职业技术学院，贵州铜仁 554300）

畜牧业中抗生素的滥用严重威胁到食品安全和人类健康，带来了药物残留、耐药致病菌、环境污染等弊端。鉴于抗生素滥用的危害，已有多个国家在养殖业中限制甚至禁止使用抗生素，如1992年瑞士立法禁止使用饲用抗生素，欧盟于1999年立法禁止使用抗生素作为促生长剂，我国近几年针对抗生素在畜牧业中滥用问题，提出禁止或者逐步禁止饲用抗生素的使用，并提出鼓励和支持抗菌肽、微生物制剂、中药提取物等新兽药研发。

枯草芽孢杆菌（B.subtilis）是一类产芽孢，好氧或兼性好氧的革兰阳性杆状细菌，是我国农业部允许直接喂养动物的菌种。枯草芽孢杆菌分布广泛，抗逆性强，一些菌株能产生蛋白酶、脂肪酶等消化酶、合成多种生理活性物质、产生抗菌脂肽、在肠道中夺氧能力强（邹艳，2017；马树瑞等，2016）。 这些优良特性在畜牧养殖业中有利于提高饲料转化率，促进动物生长发育和提高免疫力，且具无毒副作用、无残留、原生态等特性。枯草芽孢杆菌及其代谢产物，是理想的抗生素替代物之一 （王宗伟等，2015；钟蔚，2013），本研究旨在筛选寻找优良的枯草芽孢杆菌，以期将来应用于动物生产。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品、培养基及指示菌 样品来源：贵州铜仁、贵州赤水、贵州遵义等地土壤、枯叶、动物粪便。

Landy培养基：酵母粉 1 g，L-苯丙氨酸0.002 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾1 g，5水硫酸铜 0.0016 g，7水硫酸镁 0.5 g，7水硫酸亚铁0.0015 g，L-谷氨酸 0.5 g， 硫酸锰 0.005 g， 氯化钾 0.5 g，水 1 L，pH 7。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠 10 g，蒸馏水 1 L，pH 7.2。

纤维素酶检测培养基：羧甲基纤维素钠10 g，氯化钠10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，水1 L。

PDA培养基：马铃薯 200 g（洗净去皮，称取200 g马铃薯切成小块，加水煮烂，用八层纱布过滤取滤液），葡萄糖 20 g，琼脂 15～20 g，水 1 L，自然pH（不加琼脂则为PD培养基）。

YPD培养基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，水 1 L，自然pH。

MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，吐温80 1 mL，磷酸氢二钾2 g，乙酸钠 5 g，柠檬酸铵 2 g，硫酸镁 0.1 g，硫酸锰0.05 g，蒸馏水 1 L，pH 6.2±0.2。

指示菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC 25923），大肠杆菌（Escherichia coli）（ATCC 25922），黑曲霉（Aspergillus niger），产朊假单丝酵母（Candida utilis），植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为本实验室（民族中兽药分离纯化技术国家地方联合工程研究中心中兽药微生物发酵技术研究室）分离纯化鉴定保藏。

1.1.2 主要仪器 垂直流超净工作台 （ZHJHC1214C），上海智城；pH 计（DELTA 320），上海闵胜；台式高速冷冻离心机（EXPERT 16K-R），湖南吉尔森；恒温培养箱（BPH-9042），上海一恒；全自动高压灭菌锅（HVE-50），华粤；恒温震荡培养箱（DHP260），金坛市国旺试验仪器厂；安捷伦1100型液相色谱仪；安捷伦G6400三重四极杆质谱联用仪。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 选取农田、菜园等熟地，取距离泥土表面5～20 cm土壤，或采集枯叶、新鲜动物粪便，装置于无菌采样袋中，置于4℃下保藏待用。

1.2.2 菌种分离纯化 无菌条件下取采集的样品，置于灭菌的离心管，加入适量无菌蒸馏水，混匀，置于85～90℃水浴锅中水浴20 min（或水浴煮沸10 min），冷却，吸取50μL样品液涂布于LB固体培养基，37℃下培养24 h，挑取大小、形态不一致的菌落分别继续划线培养2次，得纯培养菌落，采用25%甘油 -70℃保藏待用。

1.2.3 产抗菌脂肽芽孢杆菌筛选 保藏的菌株，使用适量LB液体培养基活化，活化的菌株划线培养于LB固态培养基，待长出菌落后，挑取菌落接种于LB液体培养基，37℃下180 r/min振荡培养15 h作为种子液，种子液按1%比例接种于Landy培养基，37℃下180 r/min振荡培养24 h，8000 g离心去除菌体，以金黄色葡萄球菌及大肠杆菌为指示菌，采用琼脂扩散法测试上清液抑菌活性（制备指示菌平板，无菌打孔器打孔后，孔加入80μL上清液，37°C培养18～24 h后测量抑菌圈大小）。

1.2.4 产抗菌脂肽芽孢杆菌分子生物学鉴定 前期筛选得到数株对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有抑制效果的菌株，选择抑菌效果最好的菌株，编号为S21，菌株S21总DNA提取，16SrDNA扩增和测序由苏州泓迅生物科技有限公司完成，测序所得的16SrDNA序列校对后，与NCBI的Gen-Bank （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）数据库和http://www.ezbiocloud.net数据库分析，根据序列同源性，确定菌株的种属关系。

1.2.5 枯草芽孢杆菌S21产酶特性

1.2.5.1 蛋白酶 菌株S21使用LB培养基活化，点接种于添加了10%脱脂奶粉的LB培养基，37℃下培养60 h，观察菌落周围是否出现蛋白水解圈。

1.2.5.2 脂肪酶 菌株S21活化，点接种于添加了1%三丁酸甘油酯的LB培养基，37℃下培养72 h后观察菌落周围是否出现脂肪水解圈。

1.2.5.3 纤维素酶 菌株S21活化，点接种于纤维素酶检测培养基，37℃下培养48 h后，往平板表面倾入0.1%的刚果红溶液（盖住菌落即可），静置30 min，倒出0.1%的刚果红溶液，再往平板倾入5%氯化钠溶液，轻轻摇晃10 min，倒出5%氯化钠溶液，观察菌落周围是否出现透明水解圈。

1.2.5.4 淀粉酶 菌株S21活化，点接种于添加了1%淀粉的LB培养基，37℃下培养48 h后，往平板倒入碘液，观察菌落周围是否非蓝色圈。

1.2.6 枯草芽孢杆菌21产抗菌脂肽分离纯化及鉴定 菌株S21活化，接种于LB培养基作为种子液，种子液按1%比例接种于Landy培养基，37℃下180 r/min振荡培养30 h，8000 g离心去除菌体得上清液，上清液盐酸调节pH至2后，4℃静置过夜，7000 r/min离心得沉淀，沉淀用适量甲醇抽提（调节pH至7），蒸干得残留物，残留物加入适量蒸馏水溶解，得粗脂肽提取物。粗脂肽提取物使用半制备液相色谱进行纯化，流动相：乙腈（含0.1%三氟乙酸），水（含0.1%三氟乙酸），色谱柱：agilent XDB-C18，波长：214 nm，流速：0.8 mL/min，时间：0～35 min，90%乙腈—90%乙腈。利用安捷伦G6400三重四极杆质谱联用仪分析半制备色谱纯化得到的活性抑菌峰。

1.2.7 抗菌脂肽性质研究

1.2.7.1 抑菌谱 根据1.2.5方法制备得粗脂肽提取物，采用琼脂扩散法测试其对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，植物乳杆菌，产朊假单丝酵母，黑曲霉抑制活性（Jagadeeswari等，2010）。具体步骤为：指示菌使用LB培养基 （乳酸菌MRS培养基，霉菌PD培养基，酵母YPD培养基）活化，制备出约107cfu/mL指示菌菌液，相应指示菌固体培养基融化待其温度降至40℃左右后，按1%比例加入指示菌菌液，混匀倒平板，待平板凝固，打孔器打孔，孔中加入70μL粗抗菌脂肽，37℃下培养24 h后测量抑菌圈直径。

1.2.7.2 稳定性 热稳定性，根据1.2.5方法制备得粗脂肽提取物，分别60℃（水浴）、80℃（水浴）、100 ℃（煮沸）、121 ℃（灭菌锅） 处理 20 min，以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用琼脂扩散法测试处理后的抗菌脂肽残留抗菌活性。

酸碱稳定性，根据1.2.5方法制备得粗脂肽提取物，取粗脂肽提取物，采用HCl和NaOH分别调节其 pH 为 2、3、4、5、6、7、8、9、10， 以相应 pH相同的蒸馏水为对照，金黄色葡萄球菌为指示菌，采用琼脂扩散法测试不同pH下抗菌脂肽的抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 产抗菌脂肽芽孢杆菌筛选 利用芽孢杆菌可产生耐高温芽孢的特性，水浴加热采集的样品除去非芽孢类细菌，从铜仁、遵义等地的土壤、枯叶、动物粪便中共筛选到芽孢杆菌200余株，通过是否产抗菌物质筛选，从200余株芽孢杆菌中筛选得到产抗菌物质的芽孢杆菌4株，编号分别为 B1、Y4、S21、20。 其中 S21 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有抑制效果，其他三株根据筛选的操作方法，其发酵上清液仅仅对金黄色葡萄球菌有抑制效果。故选定编号S21的菌株为进一步研究菌株。

2.2 菌株S21分子生物学鉴定 原核生物的16SrDNA基因含有高度保守序列、中度保守和高度变异序列，可以很好区分种属关系，且序列长度1500 bp左右，测序方便。故16SrDNA鉴定是目前被最常用来作为细菌鉴定的方法 （杨霞等，2008；刘文强等，2007；焦振泉等，2001）。苏州泓迅生物科技有限公司对菌株S21总DNA提取，16SrDNA 扩增和测序，使用 seqman（7.1.0）软件分析，得到1428 bp碱基，在www.ncbi.nlm.nlh.gov网站中使用BLAST在基因库中进行同源性搜索，所得结果中表明菌株S21与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168（complete genome） （accession number:AL009126.3），Bacillus subtilis strain NCIB 3610 （complete genome）（accession number:CP020102.1） 等 Bacillus subtilis相似度达99%，http://www.ezbiocloud.net进行鉴定，发现与 Bacillus subtilis subsp.Subtilis（NCIB 3610（T））相似度为 99.79%，结合比较结果，鉴定菌株S21为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

2.3 枯草芽孢杆菌S21产酶特性 枯草芽孢杆菌在代谢过程中能产生多种酶 （刘斯斯等，2017；刘秀侠等，2017；周平等，2016）。 对枯草芽孢杆菌S21的产酶特性定性检测见图1。从图1可以发现，蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶定性检测试验中，枯草芽孢杆菌S21菌落周围均出现水解圈，说明其产蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶和淀粉酶。

图1 枯草芽孢杆菌S21产酶特性

2.4 枯草芽孢杆菌S21产抗菌脂肽分离纯化及鉴定 枯草芽孢杆菌S21产抗菌脂肽分离纯化及鉴定见图2。粗抗菌脂肽经过半制备色谱纯化和抑菌试验检测，发现保留时间为15.163 s的峰为活性峰，此活性峰经过ESI-TOF_MS质谱鉴定，可得 到 ＜M+H ＞=1008，＜M-CH2+H ＞=1022，＜M-CH2++H＞=1036 三个加氢离子峰，＜M+Na＞=1030，＜M-CH2++Na＞=1044加钠离子峰，他们之间的分子量相差 14（即 CH2-），结合文献资料（李宝庆等，2010；Xiaohong，2008；陈华等，2008），可以推断出此抗菌脂肽为surfactin族系列物，具体属于surfactin A系列、surfactin B系列还是surfactin C系列有待进一步分析。

图2 枯草芽孢杆菌S21产抗菌脂肽分离鉴定图

2.5 枯草芽孢杆菌S21产抗菌脂肽性质研究枯草芽孢杆菌S21产抗菌脂肽的抑菌性、热稳定性和酸碱稳定性见表1。从表1可知，枯草芽孢杆菌S21产抗菌脂肽对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，植物乳杆菌，黑曲霉表现出不同强弱的抑菌活性，但是对产朊假单丝酵母无抑制活性。枯草芽孢杆菌S21产抗菌脂肽能承受一定的温度，在80°C及以下温度处理，其活性损失不大，但是对高温抵抗力比较弱，100°C其活性可损失约达40%。酸碱方面，枯草芽孢杆菌S21产抗菌脂肽在碱性环境下其抑菌活性不受影响，在酸性环境下，其抑菌活性受到一定抑制，但仍然能保留较大活性，总体来说，枯草芽孢杆菌S21产抗菌脂肽热稳定性和酸碱稳定性较好。

3 讨论

Surfactin是芽孢杆菌属部分菌株代谢产生的一种由七个氨基酸和13～15个碳原子的β羟基脂肪酸链组成的环状抗菌脂肽（庄国宏，2014），研究表明surfactin具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗支原体和原虫等活性 （翟少伟等，2015；任鹏举等，2014），在医药、农业、食品、环境治理等领域具有巨大的应用前景，特别是在畜牧业中替代抗生素，具有非常好的潜力。

动物饲料中添加各种酶有利于动物生产，因为酶可以帮助消化饲料，提升饲料报酬，故酶制剂在动物生产中应用广泛 （高研等，2017；高研等，2016a； 高研等，2016b；孙玉明等，2016），利用饲用益生菌本身产酶特性，制备微生态制剂，在动物消化也可起到重要作用。

本研究筛选到一株能产对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有抑制效果抗菌脂肽的芽孢杆菌，经过分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌，进一步研究表明枯草芽孢杆菌S21产surfactin，且产蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶，其产生的抗菌脂肽抑菌谱广、热稳定性和酸碱稳定性较好，说明枯草芽孢杆菌S21是一株性能优良的菌株，能够用于动物养殖，比如作为微生态制剂、发酵饲料和饲用抗菌脂肽生产菌种。

表1 枯草芽孢杆菌S21产抗菌脂肽性能