廖 浩

(广西-东盟食品药品安全检验检测中心,广西南宁 530022)

苯并[a]芘是由一个苯环和一个芘分子稠合而成的多环芳烃类化合物[1],在环境中广泛存在,在化石能源不完全燃烧以及食品在熏制、烘烤和煎炸过程中产生,特别是发生焦糊现象时[2]。苯并[a]芘是公认的高活性强致癌有机化合物[3-4],因此,各国先后对食品中最大残留限量作出了规定。我国GB 2762-2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》中规定:谷物及其制品、肉及肉制品、水产动物及其制品为5.0 μg/kg,油脂及其制品为10 μg/kg;欧盟EC Regulation 835/2011规定为2 μg/kg。目前，食品中苯并[a]芘的检测方法主要有气相色谱质谱联用法(GC-MS)[5-6]、液相色谱荧光检测器法(LC-FLD)[7-9]、液相色谱串联质谱联用法(LC-MS/MS)[10-11],其中GC-MS法由于灵敏度不高，且热稳定性不好[12],使用受到了一定限制;LC-FLD法灵敏度高,重现性较好,在现行有效的国标中成为主要的检测方法[6,9],但是也存在定性能力不强的问题;而LC-MS/MS法则能够同时解决灵敏度与定性能力问题。在样品前处理中,目前多采用固相萃取法[7-8]、凝胶色谱法[13-14]、分子印迹柱法[11,15]进行净化。EMR-Lipid固相萃取柱是一种新型的脂质增强型净化柱,选择性强,主要吸附油脂中C5及以上的碳链,同时不会吸附其他弱极性的分析物,目前在苯并[a]芘的测定中没有文献报道。

本研究采用EMR-Lipid固相萃取柱对基质复杂的煎炸过程用油进行净化,有效消除了基质干扰,再使用超高效液相色谱-大气压化学电离-三重四极杆质谱仪(UPLC-APCI-MS/MS)进行测定,以稳定同位素稀释法定量,方法准确、快速、灵敏度高,有利于煎炸过程用油中苯并[a]芘的定性定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

煎炸过程用油 抽样自广西本地餐饮企业,共20批;大豆油 中国检科院2017年ACAS-PT459苯并[a]芘能力验证样品;空白花生油 莱阳鲁花浓香花生油有限公司;苯并[a]芘对照品 99.0%,Dr. Ehrenstorfer Gmbh;苯并[a]芘-d12对照品 97.5%,Dr. Ehrenstorfer Gmbh;乙腈 HPLC级,德国默克股份两合公司;EMR-Lipid固相萃取柱 600 mg 6 mL,美国Agilent公司。

ExionLC TRIPLE QUAD 6500+超高效液相色谱联用三重四极杆质谱仪 由Analyst 1.6.3软件控制,美国AB SCIEX公司;RRHD SB-C18液相色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm) 美国Agilent公司;XS205DU电子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;S300H超声波清洗机 德国Elma公司;KS 260摇床 德国IKA公司;Multifuge X3R冷冻离心机 美国Thermo公司;Gradient A10 Milli-Q超纯水机 法国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 质谱条件的优化 采用APCI离子源分析时,样品需要在流速大于0.5 mL/min的流动相下才能充分离子化,无法单独采用微量进样泵注入标准溶液进行优化。因此,需将液相色谱泵与微量进样泵通过三通连接混合后注入离子源中。将液相色谱流速设为0.7 mL/min,流动相为90%乙腈。同时微量进样泵以20 μL/min的流速，注入1 μg/mL的苯并[a]芘、苯并[a]芘-d12标准溶液。通过母离子扫描,可在正离子模式下见到[M+H]+峰,由于结构稳定,在加大了碰撞能量后,得到了253.1>250.1、253.1>248.1、253.1>224.1、253.1>226.2及265.2>259.3、265.2>260.3、265.2>235.1等碎片离子信息。通过优化去簇电压、碰撞能量、入口电压、出口电压等参数,使得分子离子信号达到最佳。

1.2.2 液相色谱分离条件的优化 色谱柱比较了SB-AQ、Eclipse Plus C18、SB-C18(规格均为2.1 mm×100 mm,1.8 μm)。溶剂效应方面通过进样5、10、15 μL进行比较。流动相选择方面参考了液相色谱荧光检测器的方法条件[9],分别采用了甲醇-水、乙腈-水作为流动相进行选择。结合全扫描数据,对梯度洗脱条件进行了优化,使得样品峰与杂质峰有较好的分离。流速为0.7 mL/min,流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.2.3 标准曲线溶液的配制 精密称取苯并[a]芘对照品、苯并[a]芘-D12对照品各10 mg,苯并[a]芘转移至25 mL容量瓶中,苯并[a]芘-D12转移至100 mL容量瓶中,加入乙腈定容至刻度,摇匀。将上述溶液分别转移至棕色储液瓶中,-18 ℃避光保存,得到苯并[a]芘储备液0.4 mg/mL,苯并[a]芘-d12内标储备液0.1 mg/mL。以乙腈为溶剂,将苯并[a]芘储备液逐步稀释至200、20 ng/mL,苯并[a]芘-d12内标储备液稀释至1 μg/mL,分别精密吸取一定量的苯并[a]芘标准溶液至10 mL容量瓶中,同时加入1 μg/mL的内标溶液各50 μL,以80%乙腈定容至刻度,得到质量浓度为0.1、0.5、1、5、10、20 ng/mL的标准曲线溶液,内标浓度为5 ng/mL。

1.2.4 样品前处理 精密称取1 g煎炸过程用油,加入乙腈4、8、12 mL进行比较,每4 mL乙腈中加入1 μg/mL苯并[a]芘-d12内标溶液25 μL,超声处理5 min,振摇提取15 min,4 ℃下4500 r/min离心10 min,分别吸取上清液4 mL加水1 mL混匀,过EMR-Lipid固相萃取柱净化,同时取未经净化的提取液进行比较,过0.22 μm尼龙滤膜,供LC-MS/MS检测。

1.3 数据处理

由Analyst 1.6.3软件采集到的数据，导入MultiQuant 3.0.2软件中进行数据处理,采用稳定同位素稀释法定量。以定量离子对与内标物的峰面积比值(y)对系列标准溶液质量浓度(x,ng/mL)进行回归，得到标准曲线。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

苯并[a]芘属于弱极性化合物,在电喷雾离子源(ESI)中难以电离,可在大气压光化学离子源(APPI)[16]或大气压化学离子源(APCI)[11]中电离。虽然APPI源灵敏度高,但是应用范围窄,基质效应明显[17];或是装置复杂需要在柱后输送甲苯等[16],一般不作为质谱仪标配的离子源,因此本文采用了标配的APCI离子源。为追究较高的灵敏度,本研究除采用了TRIPLE QUAD 6500+三重四极杆质谱仪外,在优化了1.2.3中较为常用的质谱条件的基础上,对不常调整或采用经验值的放电电流、喷针长度、陶瓷喷头高度等参数均进行了反复优化,通过调整,得到了最佳的响应;这部分参数不仅与化合物相关外,还与流动相的比例、流速等相关,且相互影响。优化后的质谱参数为:大气压化学电离源(APCI),多反应监测正离子模式(MRM+);气帘气(CUR):30 psi;碰撞气(CAD):11 psi;放电电流(NC):2;离子源温度(TEM):550 ℃;雾化气(GS1):40 psi;喷针长度:1 mm;陶瓷喷头高度:7.0 mm;去簇电压(DP):90 V;入口电压(EP):9 V;碰撞室出口电压(CXP):20 V;其余参数见表2。

表2 质谱参数Table 2 Mass conditions

2.2 液相色谱条件的优化

因仪器耐压高,从提高分离效率和响应方面考虑,选用了较细长的亚二微米色谱柱。由于苯并[a]芘极性弱,主要考虑采用C18色谱柱;通过实验,发现在SB-AQ、Eclipse Plus C18、SB-C18上均能较好分离,在SB-AQ上出峰较快,在SB-C18上响应较好,最后采用RRHD SB-C182.1 mm×100 mm,1.8 μm液相色谱柱进行分离。通过进样5、10、15 μL,发现无明显溶剂效应。在仪器灵敏度满足的情况下，考虑减少仪器污染的因素,采用5 μL的进样量。流动相选择方面,考虑到APCI源离子化的特点,流动相中未加入酸或铵盐,发现苯并[a]芘在乙腈中雾化效果较好,响应较甲醇略高。优化后的MRM色谱图见图1。

图1 煎炸过程用油样品中苯并[a] 芘MRM色谱图(1 μg/kg)Fig.1 MRM chroma chromatograms of benzo[a] pyrene in a deep frying oil sample(1 μg/kg)

2.3 标准曲线及线性范围

实验结果表明,苯并[a]芘在0.1～20 ng/mL内均具有良好的线性关系,回归方程为y=0.42179x+0.02229，决定系数R2=0.9997,线性关系良好。结果见图2。

图2 苯并[a]芘标准曲线Fig.2 Standard curve of benzo[a]pyrene

2.4 样品前处理方法的优化

由于苯并[a]芘的极性弱,目前多用正己烷将样品完全溶解,为后续带来了大量的油脂干扰。为去除油脂,一般多采用凝胶色谱法、固相萃取法、分子印迹柱法进行净化。凝胶色谱法消耗大量乙酸乙酯、正己烷等有机溶剂,前处理时间长,需通过加标实验来进行优化。固相萃取法则主要采用弗罗里硅藻土和氧化铝柱,其中弗罗里硅藻土小柱对大量的油脂净化效率较低;氧化铝则需用到22 g的大体积净化柱,氧化铝的活性对净化效果影响较大,调整活性繁琐需要一定经验。在采用凝胶色谱或氧化铝净化时,需对大体积的有机溶剂进行浓缩,对溶剂与旋转蒸发仪的痕量污染较敏感。分子印迹柱法较为稳定,绝对回收率高,基质效应不明显。以上方法净化后需进行浓缩及溶剂置换,操作较为繁琐。本文选择由乙腈作为萃取溶剂,溶剂中的油脂含量较少,同时采用脂质增强型EMR-Lipid固相萃取小柱进行净化。EMR-Lipid在50～80%的乙腈中净化效率高,可根据液相条件灵活调整比例,避免溶剂效应。该固相萃取小柱为自浸润型,无传统固相萃取小柱活化、淋洗、洗脱的过程,操作简便。同时比QuEChERS EMR-Lipid法[18]减少了反萃取步骤。

由于本研究采用同位素内标稀释法进行定量,通过比较苯并[a]芘-d12同位素内标的响应对萃取体积进行比较选择,发现当采用4 mL乙腈提取时,响应较低,而采用8、12 mL乙腈提取时,差异较小,为保证检出限,采用8 mL乙腈进行萃取。为验证净化效果,分别取同一份过柱前与过柱后样品溶液对比;以及净化后的基质提取液与溶剂分别配制标准溶液进行对比分析,结果见表3。通过对比内标峰的响应值,发现样品过柱前的响应为过柱后的72.4%,而基质加标为溶剂标准的97.2%。说明样品基质有较大的抑制效应,而EMR-Lipid固相萃取小柱净化充分。为简化前处理,本研究采用8 mL乙腈1次萃取不进行浓缩的方法,并采用苯并[a]芘-d12作为同位素内标进行定量。

表3 EMR-Lipid固相萃取小柱净化效果Table 3 Purification effect of EMR-Lipid solid phase extraction column

2.5 检出限与定量限

本次实验样品均检出苯并[a]芘,因此分别采用了空白花生油每1 g添加1 ng的苯并[a]芘,样品则每1 g添加1 ng的苯并[a]芘-d12内标按1.2.4进行实验。以两对分子离子信噪比均大于等于3时对应的样品含量作为检出限(LOD),信噪比均大于等于10时对应的样品含量作为定量限(LOQ),测得两种不同基质中检出限均为0.2 μg/kg,定量限为0.6 μg/kg。本法灵敏度高,测定范围广,满足了GB 2762-2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》中对苯并[a]芘的要求。

2.6 样品的加标回收与精密度

取煎炸过程用油样品1 g,分别添加20 ng/mL苯并[a]芘标准溶液50、250 μL,200 ng/mL苯并[a]芘标准溶液50 μL,内标溶液40 μL,混匀,避光静置24 h,其余步骤按1.2.4节进行,结果见表4。加标回收率在94.0%～98.7%之间,相对标准偏差在2.1%～5.6%之间。

表4 不同添加水平下苯并[a]芘的回收率与精密度(n=6)Table 4 Recoveries and RSD of benzo[a]pyrene at different spiked levels(n=6)

2.7 实际样品的测定

取20批本地不同的餐饮企业煎炸过程用油,按1.2.4测定。测得20批样品中均检出苯并[a]芘,含量在1.76～6.81 μg/kg之间。同时采用GB 5009.27-2016分子印迹柱净化液相色谱荧光检测器法对样品进行测定,本法较国标方法偏差在-1.82%～3.46%之间。取ACAS-PT459能力验证(Proficiency testing)样品测试,能力验证是利用实验室间比对来判定实验室和检查机构能力的活动,也是认可机构加入和维持国际相互承认协议(MRA)的必要条件之一。结果中的Z值是实验室测试值与所有参加比对的实验室得到的中位值之间的偏差。结果分为:满意、可疑、不满意,当Z的绝对值小于等于2时,结果为满意。测得样品Ⅰ为11.6 μg/kg,Z值为-0.1;样品Ⅲ为7.45 μg/kg,Z值为-0.3,结果满意。

3 结论

本文建立了以乙腈提取,EMR-Lipid固相萃取小柱净化作为前处理方法,并运用超高效液相色谱串联质谱测定煎炸过程用油苯并[a]芘的方法。该方法的线性范围为1～200 μg/kg，决定系数R2=0.9997，检出限为0.2 μg/kg，定量限为0.6 μg/kg。平均加标回收率为94.0%～98.7%，相对标准偏差为2.1%～5.6%。20批煎炸用油样品中，苯并[a]芘含量为1.76～6.81 μg/kg。该方法前处理简单、基质干扰少、定性定量准确、灵敏度高，适合大样品量的实验室对煎炸过程用油中苯并[a]芘的检测。