张根生,岳晓霞,王 芮,常 虹

(哈尔滨商业大学,黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076)

金属硫蛋白(MTs)是广泛存在于生物体中,具有低分子质量、富含半胱氨酸(20%～30%)、缺乏芳香族氨基酸的一类金属结合蛋白质[1-4]。金属硫蛋白可以调节生物体内微量元素浓度,对人体内重金属有解毒的作用,除此之外,金属硫蛋白对激素的调节、细胞代谢的调节、细胞分化和增殖的控制、紫外(UV)诱导反应以及清除自由基都有重要作用[5-7]。Alonso等[8]的研究表明硫蛋白可以使猪肝肾中的镉含量显著降低。MTs具有清除自由基、抑制脂质过氧化过程[9],在对保护心肌的过程中也起到了一定的作用[10]。目前已从许多海洋动物的消化腺或肝胰腺、生殖腺、肝、脑、鳃、肌肉、外套膜等组织以及幼体或成体中提取到MTs[11-15]。

近些年,在金属硫蛋白的前处理方法研究中,各国的科学家采用的方法主要为匀浆后离心法[16]。此种方法在提取MTs过程中,提取不完全,样品有损失,会影响测定结果,酸水解法的特点是水解迅速彻底,产物为L型氨基酸,不会发生消旋作用。且在酸性条件下，样品中含有巯基,较为稳定，不易被氧化,酸水解蛋白成本低、投资小,是一种被广泛使用的生产方法[17]。同时,酸水解方法中,样品在固定容器里水解,水解液过滤后进行测定[18],样品没有损失,且样品水解后澄清不影响比色,是一种比较可行的样品前处理方法,可以为金属硫蛋白样品测定前处理提供一种参照方法。

随着技术的不断改进,MTs的测定方法也逐渐精细化,从传统的金属结合法到现在的分子生物学测定手段,在技术层面极大地推动了对MTs功能及作用机制的研究[19]。除金属结合法外,MTs的检测方法还有:电化学法、免疫法、色谱分析法[20]、色质联用法[21]等。目前尚未发现一种简便快捷适用于产业化的检测技术。因此,当前亟需建立检测MTs的统一标准。巯基(SH)定量法[22],是以5,5′-二硫硝基苯甲酸(DTNB)作为巯基定量试剂,通过测定412 nm波长处显色产物硫代硝基苯甲酸阴离子(TNBA)的量,确定金属硫蛋白含量[23]。DTNB比色法操作简便易行,快速直观,可用于测定生物体中金属硫蛋白的含量,对MTs快速检测提供了一种快速检测的方法。

因此,本文将对DTNB比色法的测定条件进行优化,对其准确性进行验证,并使用酸水解作为DTNB比色法的前处理方法,对鸡全蛋粉中的MTs进行检测,以探索样品中MTs检测的新途径,为今后的MTs检测提供新的方法。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

金属硫蛋白鸡蛋粉 哈尔滨春源生物科技开发有限公司提供;DTNB 美国Sigma公司;兔肝金属硫蛋白(MTs,纯度≥95%) 上海源叶生物科技有限公司;盐酸胍、乙二胺四乙酸(EDTA)、甲醛、盐酸、柠檬酸、磷酸氢二钠等 均为国产分析纯。

双束紫外可见分光光度计 北京是普析通用仪器有限责任公司;电子天平(读数精度0.1 mg) 瑞士Mettler Toledo公司;电热鼓风干燥箱 上海东星建材试验设备有限公司;定氮仪 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;pH计 德国赛多利斯股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 金属硫蛋白标准曲线的绘制 在试管中加入标准金属硫蛋白溶液(质量浓度为1 μg/μL),加入25 μL 1.2 mol/L HCl和100 μL 0.1 mol/L EDTA,置暗处反应10 min,加入500 μL 5 mmol/L Ellma试剂混匀3 min,使MTs与DTNB形成黄色络合物,用0.1 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至10 mL,在412 nm波长处测定吸光度,并绘制标准曲线。

1.2.2 酸水解法前处理条件单因素实验

1.2.2.1 原料与盐酸用量质量体积比对处理效果的影响 称取适量样品,按照质量体积比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL加入6 mol/L HCl,充入N2密封,置于110 ℃电热干燥箱内水解16 h,水解完成后过滤水解液,取水解液测定MTs含量和水解度。

1.2.2.2 盐酸浓度对处理效果的影响 称取适量样品,按照质量体积比1∶20 g/mL加入2、4、6、8、10 mol/L HCl,充入N2封口,置于110 ℃电热干燥箱内水解16 h,水解完成后过滤水解液,取水解液测定MTs含量和水解度。

1.2.2.3 水解时间对处理效果的影响 称取适量样品,按照质量体积比1∶20 g/mL加入6 mol/L HCl,充入N2封口,置于110 ℃电热干燥箱内水解12、14、16、20、24 h,水解完成后过滤水解液,取水解液测定MTs含量和水解度。

1.2.2.4 水解温度对处理效果的影响 称取适量样品,按照质量体积比1∶20 g/mL加入6 mol/L HCl,充入N2封口,置于100、110、120、130、140 ℃电热干燥箱内水解16 h,水解完成后过滤后,取水解液测定MTs含量和水解度。

1.2.3 酸水解法前处理条件正交实验设计 为确定最佳水解方案,在单因素实验基础上,进行L9(34)正交试验,优化水解方案。正交实验设计见表1。

表1 酸水解法正交实验设计Table 1 Orthogonal design of acid hydrolysis

1.2.4 Ellma试剂最佳pH的确定 DTNB 0.297 g,盐酸胍0.086 g,EDTA 0.056 g,用pH为4、5、6、7、8的0.1 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,溶解并定容到500 mL,并每隔2 h于412 nm处测定吸光度。

1.2.5 DTNB比色法条件的研究和方法学考察

1.2.5.1 DTNB比色法反应最佳pH 吸取金属硫蛋白溶液(质量浓度为1 μg/μL),加入100 μL 1.2 mol/L盐酸溶液和200 μL 0.1 mol/L EDTA,置暗处反应10 min脱去金属,加入0.5 mL Ellma试剂,使MTs与DTNB形成黄色络合物(TNBA),再分别用pH3、4、5、6、7、8的0.1 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至10 mL,混匀静置反应3 min,在反应时间为3、10、20、30、40、50、60 h,分别于412 nm处测定吸光度。

1.2.5.2 反应的最佳pH及最佳测定时间 吸取金属硫蛋白溶液(质量浓度为1 μg/μL),加入100 μL 1.2 mol/L盐酸和200 μL 0.1 mol/L EDTA,置暗处反应10 min脱去金属,加入0.5 mL Ellma试剂,用0.1 mol/L pH7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至10 mL,混匀静置反应3 min,当反应时间为3、10、20、30、40、50、60 h于412 nm处测定吸光度。

1.2.5.3 DTNB比色法加标回收率 取一定量鸡蛋粉,分别加入不同量MTs标准溶液(质量浓度为1 μg/μL),按照测定方法做加标回收实验。计算其回收率。

1.2.5.4 精密度 配制MTs标准溶液10 μg/μL,分别取标准溶液200 μL,连续吸取6个标准溶液与500 μL 5 mmol/L DTNB试剂反应,计算得相对标准偏差(RSD),来评价其精密度。

1.2.5.5 方法检测限 取7份空白组织MTs提取液,进行测定,并计算MTs含量,按公式(1)计算方法检测限[20]。

方法检测限=t(n-1,0.99)×s

式(1)

式中:S为7次空白测定的标准差;t(6,0.99)=3.143。

1.2.6 指标测定 MTs含量计算按下式(2);

式(2)

式中:C-金属硫蛋白浓度,mg/mL;V1-测定定容体积体积,mL;V2-粗提液体积,mL;V3-粗提液测定体积,mL;m-样品质量,g。

水解度测定按下式(3);总氮测定参照GB 5009.5-2016凯氏定氮法进行[24];氨基态氮参照GBT 5009.235-2016甲醛法进行[25]。

式(3)

1.3 数据处理

试验统计分析采用Mircosoft Office 2007软件的Excel 2007进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 金属硫蛋白标准曲线

金属硫蛋白标准曲线见图1,回归方程为Y=0.019x+0.027,R2=0.999,在MTs浓度为5～40 μg/mL内成良好的线性关系。

图1 金属硫蛋白标准曲线Fig.1 Standard curve of metallothionein

2.2 酸水解前处理方法单因素实验结果

2.2.1 质量体积比对前处理效果的影响 由图2可以看出,水解度随着原料质量与盐酸体积比增大而增大,在1∶30 g/mL时,水解度增加到最大值,但当质量体积比大于1∶20 g/mL时,水解度增加不明显。MTs的含量随着质量体积比的增大,先增大后减小,在1∶20 g/mL时,MTs含量取得最大值。原因可能是,一定量的盐酸有助于蛋白质水解,提高水解度,从而鸡全蛋粉中MTs含量较高,但是随着盐酸用量的增加，也存在着盐酸过量的情况,而且过量的盐酸也不利于后期的废液处理。所以,综合考虑选取1∶20 g/mL比较适宜的质量体积比。

图2 质量体积比对前处理的影响Fig.2 Effect of mass volume ratio on pretreatment

2.2.2 盐酸浓度对前处理效果的影响 由图3可知,盐酸浓度在2～6 moL/L时,水解度和MTs含量随着盐酸浓度的增加呈现上升的趋势,盐酸浓度继续增大时,水解度趋于稳定,MTs含量在盐酸浓度8 mol/L时达到最大,但与6 mol/L时的水解度相比,差异不明显。当增加到10 mol/L时含量反而有所下降,前处理效果较差,可能是盐酸浓度过高破坏了MTs的巯基,影响比色,使含量降低。为避免巯基被破坏,综合选用6 mol/L的盐酸进行前处理。

图3 盐酸浓度对前处理的影响Fig.3 Effect of hydrochloric acid concentration on pretreatment

2.2.3 水解时间对前处理效果的影响 由图4可知,随着水解时间的延长,水解度和MTs含量呈现上升的趋势,在12～20 h内,水解度和MTs含量增加速度较大,说明前处理效果较好,在超过20 h后,其增加速度减缓,尤其是水解度增加幅度不大,在24 h时,均达到最大值。所以综合考虑,选取24 h为最佳酸水解前处理时间。

图4 水解时间对前处理的影响Fig.4 Effect of hydrolysis time on pretreatment

2.2.4 水解温度对前处理效果的影响 由图5可知,当温度为100～130 ℃时,MTs含量随着温度的升高而增大,在130 ℃时达到最大值,在140 ℃时含量稍有减少,而水解度在140 ℃时达到最大,但与130 ℃相比,水解度相差仅1.18%,另外,随着温度的升高水解液颜色逐渐变深,温度越高耗能也越高。所以应选130 ℃为适宜前处理水解温度。

图5 水解温度对前处理的影响Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on pretreatment

2.3 酸水解法前处理方法正交实验结果

由表2可以得出,以水解度为评价指标,因素影响主次为C>B>A>D，即:影响水解效果最大的因素为水解时间,其次为盐酸浓度、原料与盐酸用量质量体积比,水解温度影响较小。以MTs含量为评价指标,影响因素主次为C>B>D>A,即:影响水解效果最大的因素为水解时间,其次为盐酸浓度、水解温度、原料与盐酸用量质量体积比。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal test results

单独以水解度为指标时,由于水解度越大,蛋白质水解效果越好,可以得到更小分子的蛋白质,所以最佳的实验方案是A1B2C2D2,即水解时间20 h,盐酸浓度6 mol/L,质量体积比1∶10 g/mL,水解温度130 ℃。单独分析以MTs含量为指标的实验结果,可以得出的最佳实验方案是A3B2C3D2,即水解时间24 h,盐酸浓度6 mol/L,水解温度130 ℃,质量体积比1∶20 g/mL。分析两个指标所得到的最佳方案不同,由于较大的质量体积比1∶20 g/mL更有利于样品在盐酸内部的均匀分散,这与单因素实验结果一致,较长的时间24 h相较20 h可以使样品更大程度上的水解成小分子,所以最终选取水解时间24 h,盐酸浓度6 mol/L,质量体积比1∶20 g/mL,水解温度130 ℃为最佳前处理水解方案。对此条件进行验证,得到水解度为55.28%,MTs含量为0.4821 mg/g,所以此实验方案为最佳水解条件。

2.4 配制Ellma试剂缓冲液最佳pH的选择

由图6可以看出,DTNB在偏酸性的pH环境中，吸光度值较小且比较稳定,在pH为4时,24 h内吸光度值基本上没有明显变化,在24 h后吸光度值变化也比较小。在pH为5时,24 h内吸光度变化比较小,超过24 h后有较大变化。在pH为6时,吸光度值变化仍比较小,但是存在一些波动,尤其是在超过24 h后,吸光度有明显的提高。在pH为7、8时,吸光度值大于pH为4、5、6时的吸光度值,并且随着时间的增长,吸光度值在不断上升,这是因为，DTNB在中性或偏碱性条件下可以发生离子化,生成NTB2-,呈现黄色,在412 nm可以检测,因此为降低DTNB自身在Ellma试剂中的离子化裂解现象影响最终显色反应,应选用偏酸的缓冲液配制,这与吴云辉等[26]的研究结果一致。因此,综合评价,选择pH为4的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行配制,且为了可以准确进行实验,Ellma试剂应现用现配,避免过长时间的存放,以免影响实验结果。

图6 Ellma试剂缓冲液pH对吸光度的影响Fig.6 Optimal pH for formulation of Ellma reagent buffer

2.5 反应的最佳pH及最佳测定时间

由图7可以看出，生成物TNBA在pH7、8时,吸光度值最高,且在60 min内稳定性较好,说明TNBA在碱性条件下比较稳定。这与王俊坤[27]在DTNB比色法测定金属硫蛋白含量中的研究规律一致。

图7 Ellma试剂缓冲液在pH3～8的稳定性Fig.7 Stability of Ellma reagent buffer solution in pH3～8

由图8可知,在碱性条件下,当pH=7.2时,吸光度值最大,说明TNBA生成量最多,且TNBA在30 min内变化不大,比较稳定,而且结合Ellma试剂在中性或者偏碱性条件下会出现裂解,为保证TNBA的稳定又考虑到显色剂的性质,最终选择pH7.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行定容,并在30 min内进行检测。

图8 Ellma试剂缓冲液在pH7～8下的稳定性Fig.8 Stability of Ellma reagent buffer solution at pH7～8

2.6 DTNB比色法加标回收率、精密度、方法检测限

加标回收率、精密度、方法检测限结果分别见表4～表6,加标回收率为75.83%～88.15%,相对标准偏差为3.10%<5%,表明该方法具有较好的重现性和准确度。DTNB比色法的方法检测限为7.57 μg/g。

表3 DTNB比色法加标回收率实验结果Table 3 The results of spiked recovery by DTNB colorimetric method

表4 DTNB比色法测定结果的相对标准偏差(RSD)Table 4 Relative standard deviation(RSD)of DTNB colorimetric assay

表5 DTNB比色法方法检测限Table 5 DTNB colorimetric method detection limit

3 结论

酸水解法前处理条件为:水解时间24 h,盐酸浓度6 mol/L,质量体积比1∶20 g/mL,水解温度130 ℃,测定鸡全蛋粉中MTs含量为0.4821 mg/g,水解度为55.28%。优化了DTNB比色法测定条件,并使用DTNB比色法测定鸡全蛋粉中MTs含量,最终选用pH为4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制Ellman试剂,反应最佳pH为7.2。使用DTNB比色法测量样品中MTs含量,加标回收率最高为88.15%,相对标准偏差小于5%,DTNB比色法的方法检测限为7.57μg/g,由此可以得出该方法具有较好的重现性和准确度,本方法可以用于样品中MTs的快速检测。