袁诗俊,龚梦瑀,李梦林,顺远枫,黄 毅

(西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010)

自由基是单质或化合物均裂产生的带有未成对电子的原子或基团,研究表明其与多种疾病的发生有密切的关系[1]，能够有效抑制自由基的产生有助于有效地预防,延缓甚至治愈,如阿尔兹海默病[2]、慢性支气管炎[3]和青光眼[4]等疾病。因此,近年来,抗氧化物质,特别是天然产物来源的抗氧化物质的开发成为研究热点。大量的化妆品中添加植物抗氧化剂,对抗自由基引起的皮肤衰老[5]。很多天然食品或药品如葡萄、虎杖和桑椹中的白藜芦醇等早已作为膳食补充剂,用于保健及疾病预防[6]。

大黄(Rhubarb)是蓼科大黄属植物的干燥根茎,为我国常用中药材，其临床应用广泛,具有显著止泻、抗肿瘤和脑保护等效果。近年来,大黄抗氧化作用也受到了广泛关注,其所含大黄酸[7]、大黄素[8]等蒽醌类衍生物以及鞣质等能直接对抗自由基损伤细胞的效果,有利于机体机能修复及细胞的抗衰老,对于其他药用功效也有较强的辅助效果。

本课题组在对传统中药材抗氧化能力的初步筛选系列工作中,发现大黄具有非常强的抑制自由基活性。现有文献对其抗氧化活性的物质基础并不完全清晰,提取方面的报道更是着重某一化学类别物质的工艺优化而非以活性为检测指标,如蒽醌类[9]或多糖类[10]等。为了促进大黄作为天然抗氧化保健药食品的开发以及其抗氧化活性物质的后续分离工作,本文采用正交试验对大黄抗氧化活性物质的提取工艺进行研究,优化提取方案。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大黄(产地青海,批号 160901)药材饮片 于2017年购自四川绵阳桐君阁大药房,经鉴定为蓼科大黄属植物药用大黄(RheumofficinaleBaill)的干燥根茎,药材经60 ℃烘干,粉碎过50目筛,4 ℃避光干燥保存备用,整个提取工艺优化实验在1月内完成;DPPH(1,1-二苯-2-苦肼自由基) 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;无水乙醇 成都市科龙化工试剂厂;以上试剂 均为分析纯；纯水 为实验室自制(电阻率为18 MΩ·cm)。

7200型可见光分光光度计 龙尼柯(上海)仪器有限公司;小型中药材粉碎机 上海淀久中药机械厂;XH-C型涡旋混合器 金坛市天竟实验仪器厂;D1008E型小型离心机 美国Scilogex有限公司;KQ-200KDE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;BSA124S型电子天平 德国赛多利斯有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大黄中抗氧化物质的提取 采用超声辅助提取(功率恒定为200 W),准确称取500 mg大黄药材粉末于具塞锥形瓶中,加入10 mL无水乙醇,封口并记录瓶重,超声提取10 min后,按记录重量补足溶剂,将提取液于10000 r/min离心1 min,取上清液用于抗氧化活性检测。

1.2.2 单因素实验 影响提取效果的因素主要包括乙醇浓度,浸提温度,提取时间和固液比,通过预实验发现浸提温度对提取物抗氧化活性影响不大,因此选取剩余三因素进行单因素实验。以DPPH自由基的清除率作为考察指标,固定提取时间为10 min,固液比为1∶10条件下考察了乙醇浓度100%、80%、60%、40%和20%对抗氧化物质提取的影响;固定乙醇浓度为100%,固液比为1∶10,考察浸提时间10、30、50、70和90 min对抗氧化物质的提取影响;固定乙醇浓度100%,浸提时间10 min,考察固液比为1∶90、1∶70、1∶50、1∶30、1∶10对大黄中抗氧化活性物质提取的影响。为保证固液比测定的准确性,不同固液比提取的最终溶液均稀释到相同浓度进行抗氧化活性比较。

1.2.3 正交试验 参考报道[11]文献,在各单因素实验的自由基清除率极大值附近选取三个水平,以DPPH自由基清除率为指标,设计3因素3水平正交表L9(34)进行正交试验,优化大黄中抗氧化活性成分的提取工艺。

表1 L9(34)正交实验因素与水平Table 1 Factors and levels in the L9(34)orthogonal test

1.2.4 DPPH抗氧化活性检测 抗氧化活性测定包括DPPH法、羟基自由基、超氧阴离子自由基、总还原力和铁螯合能力测定等多种方法,在预实验中笔者发现以上方法结果具有一致性。为方便工艺研发中活性的快速跟踪,本实验选用了较为简便的DPPH自由基清除率实验来进行抗氧化活性判定。采用Pyrzynska等[12]报道的方法略作修改,准确移取200 μL样品溶液与4 mL DPPH溶液(30μg/mL,由无水乙醇配制,该溶液在517 nm处吸光度值约为0.8)于试管中,涡旋混匀后避光5 min,10000 r/min离心1 min,取上清液转入比色皿,室温下测定517 nm处吸收值。该值伴随自由基清除剂量的增多而减弱,样品抗氧化能力可用清除率(Scavenging rate,简写为SR%)来表示,计算公式如下:

SR(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai为0.2 mL测试溶液与4 mL DPPH溶液混合后的吸光度值;Aj为0.2 mL测试溶液与4 mL无水乙醇溶剂混合后的吸光度值;A0为0.2 mL制备测试溶液时所用溶剂与4 mL DPPH溶液混合后的吸光度值。

1.3 数据处理

所有实验平行测定3次,单因素实验结果用平均值±SE表示,正交实验结果用平均值表示,采用SPSS 20.0软件进行ANOVA分析(显著性水平p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度 由图1可知,乙醇浓度小于60%时,自由基清除率缓慢提高。伴随乙醇浓度的继续上升,清除率大幅下降。可推断大黄中抗氧化活性物质主要为亲水性化合物,其更易溶于水而非乙醇。在后续正交试验中乙醇浓度这一因素选择40%、60%和80% 这3个水平进行正交试验。

图1 乙醇浓度对清除率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on clearance rate

2.1.2 提取时间 由图2可知,提取时间对抗氧化活性的影响呈钟形分布。提取开始后,伴随时间延长,溶剂充分浸透大黄粉末,促进了颗粒中抗氧化物质的充分溶出,使得清除率增加,抗氧化活性升高，到30 min时清除率基本达到最大值,此后,自由基清除率反而伴随时间延长而下降,原因可能是超声时间过久,超声波的空化效应和热效应都会破坏抗氧化活性物质的结构[13]。后续正交试验中提取时间选取10、30和50 min 3个水平进行正交试验。

图2 提取时间对清除率的影响Fig.2 Effect of extraction time on clearance rate

2.1.3 固液比 由图3可知,固液比在1∶10～1∶30(即样品浓度大于33 mg·L-1)时,DPPH的清除率随着溶剂占比的增加而增大,说明伴随溶剂量的增加,样品中抗氧化活性物质与溶剂接触面积增加,使得更多的抗氧化活性物质有效溶出，但当固液比达到1∶30并继续增加溶剂量时,提取液对DPPH自由基的清除率并未继续上升而是基本保持恒定状态。鉴于溶剂用量过大会造成成本上升,因此选取1∶10、1∶30和1∶50这3个水平进行正交试验。

图3 固液比对清除率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on clearance rate

2.2 正交实验及验证

正交试验结果及分析见表2和表3,极差R值反应出,影响大黄提取物的抗氧化活性的因素由主到次依次为A时间>B乙醇浓度>C固液比。A因素第2水平的均值最大,故因素A的优选水平为2,同理因素B和C的优选水平均为2。所以本实验的最佳工艺条件为A2B2C2,即提取时间为30 min,乙醇浓度为60%,固液比为1∶30。

表2 正交试验结果及极差分析Table 2 Orthogonal test results and range analysis

表3 方差分析表Table 3 Variance analysisTable

根据以上最优条件:提取时间30 min,乙醇浓度60%和固液比为1∶30进行最优工艺验证,3组平行实验得到的结果为96.02%±1.36%,该结果符合预期且优于以上所有水平表现,表明该优化参数可行。

3 结论

由于抗氧化活性物质种类多样,已报道的工艺开发方法虽然明确了化合物类别,但提取时容易遗漏具有抗氧化活性的其他类成分。本研究以生物活性为指标进行工艺优化避免了以上问题的出现。最终,通过单因素和正交试验,以提取物对自由基的清除率为指标,得到大黄抗氧化活性物质的最佳提取条件为提取时间30 min、乙醇浓度60%和固液比为1∶30,此时其自由基清除率可达96.02%±1.36%,该工艺可为大黄作为保健药食品的开发利用提供一定的理论和应用依据。