冯 鑫,何承云,徐茜茜,焦凌霞

(河南科技学院食品学院,河南新乡 453003)

酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)主要存在于土壤及水果加工产品中,具有在低pH和高温条件下生存的能力,可导致酸性果汁在货架期发生腐败变质,使产品具有药味和腐败味等异味[1-2]。1998年的美国食品加工商协会(NFPA)报告显示,35%的果汁污染与嗜酸芽孢杆菌有关,而引起酸性果汁腐败的嗜酸芽孢杆菌主要是酸土脂环酸芽孢杆菌。该菌属最早在巴氏灭菌苹果汁中发现[3],随后相继在橙汁、番茄汁、菠萝汁、西番莲汁、葡萄汁、芒果汁及罐装番茄丁等产品中检出酸土脂环酸芽孢杆菌[4-6]。目前,由酸土脂环酸芽孢杆菌引起的腐败，给果汁加工业造成了巨大的经济损失。研究认为，控制酸土脂环酸芽孢杆菌污染，是防止酸性饮料变质的关键,国际出口贸易中严格要求，每10 mL浓缩果汁中，该菌的含量不大于一个[7],因此，酸土脂环酸芽孢杆菌的危害控制，已成为果汁产业普遍关注的问题。

酸土脂环酸芽孢杆菌是耐酸、耐热、好氧型、革兰氏阳性芽孢杆菌,呈杆状或短杆状,生长pH范围为2.5～6.0,生长温度范围为25～60 ℃,在不利于营养菌体生长的条件下形成中生芽孢、近端芽孢或终端椭圆形芽孢[8],该菌芽孢具有更强的耐高温高酸特性,其芽孢经传统的巴氏杀菌(92 ℃,10 s)处理仍能够存活,在苹果汁中的D值范围为D90 ℃=11.1 min至D100 ℃=0.7 min[9],对果汁工业的灭菌工艺提出了严峻的挑战。休眠中的芽孢对外界环境非常敏感,一旦受到外源营养物(L-氨基酸、嘌呤氨基酸、AGFK)或非营养物(溶菌酶、盐、高压、Ca2+-DPA、表面活性剂)等刺激，即可启动萌发,恢复到一个活跃的营养菌体形式[10-11]。存在于果汁中的酸土脂环酸芽孢杆菌，其芽孢在适宜环境下就会迅速启动萌发，进而生长繁殖,导致果汁腐败变质[12]。芽孢是细菌生长的特定阶段,它的形成与菌种有关,不同菌种的芽孢形成条件不同,同时还受到营养物质及环境因素的影响[13]。本论文通过单因素和双因素交互试验，研究碳源、氮源及多种无机盐对酸土脂环酸芽孢杆菌菌体生长和芽孢形成的影响,旨在探索影响该菌芽孢形成的因素及形成规律,为控制该菌芽孢污染及酸性水果产品保藏提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸土脂环酸芽孢杆菌(AlicyclobacillusacidoterrestrisDSM 3922T) 德国菌种保藏中心;葡萄糖、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸锰、硫酸铵 均为分析纯,天津市德恩化学试剂有限公司;酵母提取物、蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司。

Quanta 200环境扫描电子显微镜 美国FEI公司;Varioskan Rash多功能酶标仪 美国赛默飞世尔科技公司;HV85全自动高压灭菌锅 平山制作所株式会社(HIRAYAMA);SW-CJ-IF型单人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司;DNP-9052型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;ZQTY-70F型振荡培养箱 上海知楚仪器。

1.2 培养基的制备

Alicyclobacillusacidoterrestrismedium(AAM)液体培养基:葡萄糖2.0 g,酵母浸粉2.0 g,MgSO4·7H2O 1.0 g,CaCl2·2H2O 0.5 g,KH2PO41.2 g,MnSO4·4H2O 0.5 g,(NH4)2SO40.4 g,无菌水定容至1 L,调节pH为4.0,作为芽孢形成试验的基础培养基;

计数培养基(SK固体培养基[14]):酵母浸粉2.5 g,蛋白胨5.0 g,葡萄糖1.0 g,CaCl20.25 g,琼脂15 g,无菌水定容至1 L,调节pH为4.0,菌落计数用。

1.3 实验方法

1.3.1 酸土脂环酸芽孢杆菌生长曲线及芽孢形成曲线测定 挑取平板上酸土脂环酸芽孢杆菌单菌落,接种到AAM液体培养基中,45 ℃,250 r/min振荡培养6 h活化菌种,经活化后的菌悬液中活菌数约达108cfu/mL。将此菌悬液按1%的接种量转接到100 mL AAM液体培养基中(500 mL三角瓶),45 ℃,250 r/min振荡培养24 h。每2 h取出3 mL菌液,采用稀释涂布平板法，测定菌体总数和芽孢数[15]。其中1 mL菌液进行梯度稀释后涂布平板,测得的菌落总数即为菌体总数;1 mL菌液置于80 ℃水浴中处理20 min,除去酸土脂环酸芽孢杆菌营养菌体后，再进行梯度稀释,然后涂布平板,测得菌落总数即为芽孢数;另外1 mL菌悬液于5000×g条件下离心10 min，收集菌体,用来进行菌体形态的扫描电镜观察。芽孢数与菌体总数的比值即为芽孢形成率(芽孢形成率=芽孢数/菌体总数×100)。以培养时间为横坐标,菌体总数和芽孢数的对数值为纵坐标,制作菌体生长曲线和芽孢形成曲线。

1.3.2 菌体形态的扫描电镜观察 将1.3.1中离心收集的菌体用预冷的无菌超纯水反复清洗5次,置于含有2.5%的戊二醛(C5H8O2)溶液中，进行菌体形态的固定,4 ℃固定2 h备用。将固定好的样品用无菌超纯水清洗1次,再用乙醇梯度脱水(35%、50%、70%、80%、90%、100%)1～2次,每次脱水10～15 min。将脱过水的样品浸泡在乙酸异戊酯(C7H14O2)与乙醇1∶1的混合液中15～20 min,再置于乙酸异戊酯中浸泡20 min并温和振摇,自然风干后，利用扫描电镜观察菌体的形态变化。

1.3.3 营养因子单因素水平设置 以AAM液体培养基中各种营养因子的添加量为固定水平,分别进行梯度递减和增加,共设置5个水平。取活化后的菌液,按1%的接种量，分别接入含有不同浓度营养因子的50 mL培养基(250 mL三角瓶)中,45 ℃,250 r/min振荡培养24 h,按照1.3.1所述方法取样，检测菌体总数和芽孢数,每个处理设3个重复。进行单因素试验。

碳源:以葡萄糖作为唯一碳源,浓度设定为0、1、2、3、4 g/L。

氮源:以酵母浸粉作为有机氮源,(NH4)2SO4作为无机氮源。酵母浸粉的浓度设定为0、1、2、3、4 g/L;(NH4)2SO4的浓度设定为0、0.2、0.4、0.6、0.8 g/L。

无机盐:本实验中的无机盐包括CaCl2、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4。CaCl2的浓度设定为:0、0.19、0.38、0.57、0.76 g/L;MnSO4·H2O的浓度设定为:0、0.19、0.38、0.57、0.76 g/L;MgSO4·7H2O的浓度设定为:0、0.5、1、1.5、2.0 g/L;KH2PO4的浓度设定为:0、0.6、1.2、1.8、2.4 g/L。

1.3.4 营养因子双因素试验 根据单因素实验结果,设计双因素实验(表1)，观察不显著因素的交互作用对酸土脂环酸芽孢杆菌的菌体生长和芽孢形成的影响。

表1 三种非显著营养因子缺陷的培养基Table 1 The mediums of defecting three kinds of non-significant nutritional factors

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 酸土脂环酸芽孢杆菌生长及芽孢形成

酸土脂环酸芽孢杆菌在45 ℃条件下生长状况良好,培养2 h后进入对数生长初期,培养6～8 h为对数中期,12 h进入稳定期(图1)。一些营养菌体在培养8 h时，出现顶端膨胀,10 h时，大多数菌体进入芽孢形成阶段,18 h时，菌体几乎全部形成芽孢(图2)。

图1 酸土脂环酸芽孢杆菌DSM 3922T 在45 ℃条件下的生长和芽孢形成曲线Fig.1 Growth and spore formation curve of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T at 45 ℃

图2 酸土脂环酸芽孢杆菌DSM 3922T在45 ℃条件下培养不同时间的菌体形态Fig.2 Microbial morphology of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922Tat 45 ℃ for varying durations注:A:6 h,B:8 h,C:10 h,D:18 h。

2.2 碳源对酸土脂环酸芽孢杆菌生长及芽孢形成的影响

由图3可知,当培养液中不含葡萄糖时,45 ℃,250 r/min振荡培养24 h,菌体总数为7.06 lg cfu/mL,芽孢数为6.92 lg cfu/mL,芽孢形成率为73.2%。随着培养基中葡萄糖浓度的提高,菌体总数和芽孢数均有所增加。当葡萄糖浓度增加到2 g/L时,菌体总数达到7.66 lg cfu/mL,芽孢数达到7.64 lg cfu/mL,芽孢形成率达到97.8%,较对照组提高了24.6%。继续提高葡萄糖浓度,菌体总数和芽孢数均无明显增加。方差分析结果表明，葡萄糖对酸土脂环酸芽孢杆菌的菌体生长和芽孢形成影响显著(p<0.05)。

图3 葡萄糖浓度对酸土脂环酸芽孢杆菌 DSM 3922T菌体总数和芽孢数的影响Fig.3 Effects of glucose concentrations on cell growth and spore production of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T注:不同小写字母表示同一指标间 差异显著(p<0.05),图4、图5同。

碳源是细胞生长和新陈代谢必需的营养物质,其种类和浓度直接影响芽孢的形成速率和产量。王天云等[16]探讨培养基成分对乳酸芽孢杆菌芽孢形成的影响时,发现碳源浓度是影响乳酸芽孢杆菌芽孢形成的关键因素。Osadchaya等[17]通过丰富芽孢培养基碳源的组成,使细胞和芽孢产量较单一碳源时有了显著提高。本试验发现葡萄糖对酸土脂环酸芽孢杆菌的营养菌体生长和芽孢形成具有显著的促进作用,当其浓度达到2 g/L时,即可有效地提高菌体总数和芽孢形成率。

2.3 氮源浓度对酸土脂环酸芽孢杆菌生长及芽孢形成的影响

由图4A可知,当培养液中不含酵母浸粉而以(NH4)2SO4为唯一氮源时,45 ℃,250 r/min振荡培养24 h,菌体总数为6.61 lg cfu/mL,芽孢数为6.53 lg cfu/mL,芽孢形成率为82.54%。当酵母浸粉添加浓度为1 g/L时,菌体总数增加至7.70 lg cfu/mL,芽孢数增加至7.68 lg cfu/mL,芽孢形成率由82.54%提高到95.41%。继续增加酵母浸粉的浓度,菌体总数和芽孢数均不再随酵母浸粉浓度的提高而明显增加。当培养基中酵母浸粉的添加量为2～4 g/L时,菌体总数分别为7.66、7.63和7.63 lg cfu/mL,芽孢数分别为7.64、7.61和7.62 lg cfu/mL。研究表明,培养基中的氮源也是影响芽孢形成的因素之一[18],方差分析结果表明，酵母浸粉作为唯一有机氮源，对酸土脂环酸芽孢杆菌菌体生长和芽孢形成具有显著的影响(p<0.05),而无机氮源(NH4)2SO4对菌体生长和芽孢形成在p<0.05水平上影响不显著(图4B)。即使培养基中不含(NH4)2SO4，而以酵母浸粉为唯一碳源时,菌体总数仍高达7.69 lg cfu/mL,芽孢数达7.67 lg cfu/mL,而且增加(NH4)2SO4的添加浓度,菌体总数和芽孢数均无增加趋势。

图4 酵母浸粉和(NH4)2SO4 对Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T菌体生长和芽孢产量的影响Fig.4 Effects of yeast extract and(NH4)2SO4 concentrations on cell growth and spores production of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T

一般来讲,有机氮源营养丰富,比无机氮源更有利于营养菌体生长,但是对细菌芽孢形成的影响并不清楚。作为革兰氏阳性菌的模式菌株,枯草芽孢杆菌B68在以无机氮为唯一氮源时，生长较弱,在有机氮源中长势较好[19]。酸土脂环酸芽孢杆菌对有机氮源的利用也明显高于无机氮源,在以酵母浸粉为唯一氮源时,比以(NH4)2SO4为唯一氮源时所得的菌体总数提高了11.02倍,芽孢数提高了12.81倍,芽孢形成率提高了12.96%。

2.4 无机盐对酸土脂环酸芽孢杆菌生长及芽孢形成的影响

AAM培养液中的无机盐成分为CaCl2、KH2PO4、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O,各种无机盐离子对酸土脂环酸芽孢杆菌的菌体生长和芽孢形成的影响如图5所示。方差分析结果表明，Ca2+和K+浓度对菌体生长及芽孢形成的影响均不显著(p>0.05),即使培养液中不含Ca2+或K+,菌体总数也达到7.59 lg cfu/mL,芽孢数达到7.49 lg cfu/mL,芽孢形成率为80.51%(图5A、5B)。研究认为,在芽孢形成过程中,母细胞中产生的PDA与Ca2+结合形成Ca2+-DPA复合物,贮存在芽孢核中,在降低芽孢核含水量、增强芽孢耐热性方面起着重要的作用[20]。金华等[21]研究发现,当溶液中含有较高浓度的钙离子时,丁酸梭状芽孢杆菌形成的芽孢数量较多,培养基中CaCl2浓度为0.8 g/L时,菌体数量和芽孢形成率均获得最大值。陈秋红等[22]研究发现,培养基中添加K2HPO4后凝结芽孢杆菌的菌体数量、芽孢数量和芽孢形成率均有所提高,表明K+对凝结芽孢杆菌的菌体生长和芽孢形成有促进作用。在本试验中,培养液中单一缺乏Ca2+和K+，对酸土脂环酸芽孢杆菌的菌体生长和芽孢形成均无显著影响,增大CaCl2和KH2PO4的添加浓度对该菌的菌体生长和芽孢形成也没有显著的促进作用。酸土脂环酸芽孢杆菌具有嗜酸耐热的双重生理特性,其芽孢具有更强的耐热耐酸等抗逆特性,参与其芽孢形成过程的必需离子是否与其他种属的微生物不同，仍需进一步的研究。

由图5C可知,培养液中Mn2+浓度对酸土脂环酸芽孢杆菌菌体生长及芽孢形成的影响显著(p<0.05)。培养液中不含Mn2+时,菌体总数为7.58 lg cfu/mL,芽孢数为7.49 lg cfu/mL,芽孢形成率为80.25%。Mn2+添加浓度较低时(0.24～0.48 g/L),对菌体生长和芽孢形成有一定的促进作用,继续增加Mn2+的添加浓度,菌体总数和芽孢数均呈下降趋势,当Mn2+浓度达到0.96 g/L时,菌体总数仅为4.03 lg cfu/mL。结果表明,一定浓度的Mn2+可以促进酸土脂环酸芽孢杆菌的营养菌体生长和芽孢形成,高浓度Mn2+反而抑制其菌体生长。这与文献报道的Mn2+含量达到某一域值时，将会抑制菌体生长的结论相一致[23]。而在此Mn2+浓度下,芽孢数为4.00 lg cfu/mL,芽孢形成率高达96%,可见高Mn2+浓度对其菌体生长有明显的抑制作用,但却促进了芽孢形成。据报道,多种金属离子可以促进细菌芽孢的形成[24]。Mn2+作为一种微生物生长所需的微量元素是超氧化物歧化酶、L-阿拉伯糖异构酶等许多酶的辅助因子,与碳水化合物的代谢有密切关系,影响细胞的生长和芽孢的形成[18],已有研究表明,金属离子Mn2+能促进芽孢产生,提高芽孢得率[22,25-26],本研究也得到了同样的结论。

图5 CaCl2、KH2PO4、MnSO4、MgSO4浓度对酸土脂环酸芽孢杆菌DSM 3922T菌体生长和芽孢形成的影响Fig.5 Effects of CaCl2,KH2PO4,MnSO4 and MgSO4 concentrations on cell growth and spore production of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T

由图5D可以看出,Mg2+对酸土脂环酸芽孢杆菌菌体生长和芽孢形成的有显著的影响(p<0.05),增加Mg2+浓度可以显著提高酸土脂环酸芽孢杆菌的菌体总数、芽孢数和芽孢形成率。在Mg2+的添加浓度为0～0.34 g/L的范围内,菌体总数随Mg2+浓度的增加而增加。当Mg2+浓度为0.34 g/L时,与不含Mg2+的对照组相比,菌体总数从3.72 lg cfu/mL增加到7.66 lg cfu/mL,芽孢数从3.18 lg cfu/mL增加到7.64 lg cfu/mL,芽孢形成率也由29.31%上升到95.80%。继续增加Mg2+浓度,菌体总数没有显著变化,芽孢数略有降低,可见高浓度Mg2+对酸土脂环酸芽孢杆菌菌体生长和芽孢形成没有明显的抑制效果。姚露燕等[27]发现,一定浓度的Mg2+对枯草杆菌BS-MM03的菌体生长及芽孢形成均有显著的促进作用,但当Mg2+浓度大于0.03%时,菌体总量和芽孢形成率均下降。另有文献报道,对于纳豆芽孢杆菌,Mg2+有利于其菌体生长但不利于其芽孢的行成[28],而对丁酸梭状芽孢杆菌,增加Mg2+浓度对其菌体生长没有明显的促进作用,但能促进其芽孢形成[21]。这些研究表明,Mg2+对不同微生物的菌体生长和芽孢形成有着不同的影响。Kolodziej 和Slepecky[29]推测,Mg2+是作为芽孢转化过程中关键酶的辅助组分而起作用,其对不同微生物芽孢形成的影响机理尚待进一步研究。

2.5 不显著因素交互作用对芽孢形成的影响

表2 不显著营养因子的交互作用 对Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T菌体生长和芽孢形成的影响Table 2 Effects of interaction of two non-significant nutritional factors on cell growth and spore production of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T

3 结论