刘登勇,刘 欢,张庆永,戚 军,徐幸莲

(1.渤海大学食品科学与工程学院,生鲜农产品贮藏加工 及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013; 2.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心,江苏南京 210095; 3.山东德州扒鸡股份有限公司,山东德州 253003)

酱卤肉制品是最典型的一大类中华传统熟肉制品,卤煮是其最关键的加工工艺[1]。德州扒鸡是酱卤肉制品的主要代表,被誉为“中华第一鸡”,具有风味醇厚、熟烂脱骨等特点,深受广大消费者喜爱。

风味是评价食品品质最重要的指标之一,包括滋味和气味。扒鸡最主要的滋味是咸味和鲜味,咸味主要来自每次煮制前所加的食盐,同时可能受卤汤中其它呈味物质的影响,鲜味则主要来自卤汤和鸡肉中的鲜味物质,业界普遍认为“老汤对扒鸡加工至关重要,老汤品质决定扒鸡风味品质”。老汤由新汤发展而来,新汤最初是在清水中加入多种香辛料和调味料(扒鸡加工工艺仅用食盐)，并按特定比例配制而成,随着卤汤煮制次数的增加和不断补料,鸡肉和香辛料中可溶性物质越来越多地溶解于卤汤中,卤汤中风味物质等渗入到鸡肉中,肉-汤传质逐渐趋向平衡,卤汤也逐渐演化为一个成分较为稳定的复杂多组分分散体系——老汤,包括蛋白质、脂肪、氯化钠、有机酸、糖类、各种香辛料浸出物,以及肌肉中三磷酸腺苷(ATP)降解产生的5′-核苷酸类、蛋白质水解产生的肽类、游离氨基酸等[2-3],这些物质的协同作用可给产品带来醇厚绵长的丰富滋味。

关于扒鸡的研究,此前多集中在营养物质分析等方面[4-6],对卤汤的研究内容较少涉及。本研究依据德州扒鸡经典配方与工艺制作卤汤,并跟踪分析多次反复煮制后，卤汤中游离氨基酸、核苷酸等主要非盐呈味物质的组成与含量,为揭示老汤品质形成规律、解释扒鸡产品滋味特性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

卤汤(新汤与老汤)样品 由山东德州扒鸡股份有限公司提供;试验中所用的扒鸡 山东德州扒鸡股份有限公司饲养的雄性华北柴鸡,鸡龄为30 d,体重约800 g；5′-二腺苷磷酸(5′-Adenosine diphosphate,5′-ADP)、5′-腺苷酸(5′-Adenosine monophosphate,5′-AMP)、5′-肌苷酸(5′-Inosine monophosphate,5′-IMP)5′-鸟苷酸(5′-Guanosine monophosphate,5′-GMP)、次黄嘌呤(Hypoxanthine,Hx)和肌苷(Inosine,I)等核苷酸标准品与丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸等游离氨基酸标准品 均购于sigma-aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

L-8900全自动氨基酸分析仪 日本Hitachi公司;1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司;TSK-gel ODS-80 TM色谱柱 日本Tosoh公司;MiliQ超纯水系统、346-37真空泵 美国MILLIPORE公司;Allegra 64R冷冻离心机 美国Beckman公司。

1.2 实验方法

1.2.1 扒鸡煮制工艺 第n次卤煮扒鸡结束后，取出扒鸡与香辛料料包,再按照新一批扒鸡胴体质量补充固定比例的食盐与香辛料(企业保密配方),混匀后加入扒鸡胴体,然后添加水分至与第n次煮制时的相同刻度,最后进行第n+1次卤煮,即一个煮制循环。每次卤煮扒鸡数量(84只)与总质量(67 kg左右)保持一致,并按照固定比例的肉汤比与料汤比对卤汤进行复原配制。另外,扒鸡卤煮工艺固定,时间为4.5 h,具体升温程序包括升温卤煮(室温升至90 ℃,20 min)、恒温卤煮(90 ℃,20 min)、高温焖煮(99 ℃,100 min)、降温焖煮(90 ℃降至80 ℃,40 min)与低温焖煮(80 ℃,90 min)。

1.2.2 卤汤样品 将香辛料、调味料(食盐)和胴体鸡肉按特定比例加入清水中煮制扒鸡,煮制后将卤汤复原配制,即一个煮制循环。卤汤分为配制新汤、特定循环次数煮制新汤和老汤。配制新汤:将各种香辛料和调味料按比例加入清水中,混匀后取样,样品编号为“0”;煮制新汤:在配制新汤中按一定肉汤比(1∶3)加入已完成各种工艺处理的胴体鸡肉,补料,煮制,取样,每3个煮制循环取样1次,样品编号分别为“3、6、9、12、15、18、20”;老汤:多年循环使用的老汤,样品编号为“A”。

1.2.3 卤汤预处理 撇除浮于卤汤表层的油脂,然后用200目的纱布过滤,除去肉末、香辛料碎渣等大块固形物,最后通过离心(3000 r/min,5 min)处理，除去较小的颗粒沉淀,使卤汤样品呈均一、稳定状态。

1.2.4 游离氨基酸组成与含量分析 参考陶正清等[7]、Kobayashi等[8]方法并作适当修改,具体方法如下:称取2 g左右混匀后的扒鸡卤汤,加入4 mL质量浓度为3 g/100 mL磺基水杨酸溶液,4 ℃静置12 h,离心(4 ℃,10000 r/min,10 min)后取上清液,再加入2 mL正己烷,然后用漩涡仪(3000 r/min,60 s)混匀振荡,静置分层后用0.22 μm滤膜过滤,最后用氨基酸自动分析仪检测。

1.2.5 核苷酸组成与含量分析 参照Dai等[9]、孙承锋等[10]、邱伟强等[11]和李阳杰等[12]的方法,并稍作修改。具体方法如下:

混合标准溶液的配制:分别准确称取10 mg左右5′-AMP、5′-ADP、5′-IMP、5′-GMP、Hx、I标准品,用超纯水定容至1 mL,得到6种浓度为10 mg/mL的标准储备液,放置4 ℃冰箱中保存备用。然后分别取10 mg/mL的5′-ADP、5′-AMP、5′-IMP、5′-GMP、Hx、I标准品各5 mL,超纯水定容至100 mL,得到浓度为500 μg/mL的混合标准品溶液,最后用超纯水稀释为400、200、100、50、25、10、5、2.5 μg/mL的混合标准品溶液。

样品制备:称取10 g左右均一、稳定的扒鸡卤汤样品,离心(4 ℃,10000 r/min,15 min),再将上清液与乙酸乙酯均质混匀(V∶V=1∶1,4 ℃,10000 r/min,20 s),然后往混合液中加入30 mL 5%的高氯酸溶液(HClO4),冰浴条件下用高速分散器均质(10000 r/min,2×20 s),再用10 mL 5%的HClO4洗涤分散器,洗液与均质液合并,离心(4 ℃,10000 r/min,10 min),沉淀物用10 mL同浓度的HClO4洗涤,并在上述相同条件下再次离心,合并两次上清液。将上清液用中速滤纸过滤,用1和0.5 mol/L的KOH溶液调节pH至5.4,定容至100 mL,最后过0.22 μm水相滤膜后，于高效液相色谱仪器(HPLC)进样分析。

色谱条件优化:选取浓度为400 μg/mL的混合标准溶液进行分析,比较pH为5.5、6.5、6.8的0.05 mol/L的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠混合溶液及pH为4.3、5.4、6.5的0.05 mol/L的磷酸二氢钾对六种核苷酸的分离效果。

HPLC主要色谱条件:TSKgel ODS-80TM色谱柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)柱温为30 ℃,紫外检测波长为254 nm,进样量为10 μL,流速为0.8 mL/min.。流动相:洗脱液A为甲醇,洗脱液B为pH5.4的0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲液;流动相经0.45 μm滤膜过滤后,在室温下超声脱气30 min。采用二元流动相进行梯度洗脱分离,其中甲醇0.05 mol/L 的磷酸二氢钾随时间配比为:0 min:0%/100%;11 min:10%/90%;18 min:0%/100%;23 min:0%/100%,检测时间为23 min。

1.2.6 滋味活性值(TAV)与等鲜浓度(EUC)计算 TAV反映单一化合物对整体滋味的贡献,参考Chen等[13]的方法进行计算,即TAV=滋味物质浓度/该物质的呈味阈值。当TAV小于1时,该物质对滋味贡献不大;而当TAV大于1时,该物质对滋味有显著影响,且数值越大其贡献也越大。

EUC是衡量呈现谷氨酸单钠盐(MSG-like)滋味活性的氨基酸类(天冬氨酸,谷氨酸)与5′-核苷酸整体对食品鲜味(umami)的贡献,参考Yamaguchi等[14]的方法进行计算:

Y=∑aibi+1218(∑aibi)∑ajbj

式中：Y是鲜味浓度衡量(g MSG/100 g),ai为鲜味氨基酸(Glu或Asp)的浓度(g/100 g),bi为鲜味氨基酸相当于MSG的相对鲜度系数(Glu为1;Asp为0.077);aj为呈味核苷酸(5′-AMP、5′-IMP、5′-GMP)的浓度(g/100 g),bj为呈味核苷酸相对于IMP的相对鲜度系数(5′-AMP为0.18;5′-IMP为1;5′-GMP为2.3)。

1.3 数据处理

采用SPSS 19软件中的单因素方差分析(One-Way ANOVA)法对试验数据进行处理与分析,结果以平均值±标准差的形式表示,显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸含量分析

游离氨基酸是卤汤的主要滋味呈味物质之一,其种类与含量对卤汤风味具有重要作用。氨基酸含量的高低与其形成和降解量比率有关[15]。由表1可知,卤汤中鲜味氨基酸(umami amino acid,UAA)主要包括谷氨酸(Glutamic acid,Glu)、天冬氨酸(Aspartic acid,Asp),甜味氨基酸(sweet amino acid,SAA)主要有丝氨酸(Serine,Ser)、丙氨酸(Alanine,Ala)、甘氨酸(Glycine,Gly)、苏氨酸(Threonine,Thr)和脯氨酸(Proline,Pro),苦味氨基酸(bitter amino acid,BAA)主要包括精氨酸(Arginine,Arg)、甲硫氨酸(Methionine,Met)、异亮氨酸(Isoleucine,Ile)、亮氨酸(Leucine,Leu)、酪氨酸(Tyrosine,Tyr)、苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)、缬氨酸(Valine,Val)和赖氨酸(Lysine,Lys)等。其中,BAA种类最多,含量约占总游离氨基酸的1/2。UAA中Glu与Asp具有酸味,但是当存在钠盐时,它们可以提供强烈的鲜味,是最主要的鲜味氨基酸[14]。扒鸡新汤体系趋于平衡状态后,Cys含量最低,为0.99 mg/100 g。原因可能是Cys含有-SH基团,易于氧化而失去氨基酸性质[16],因而氨基酸增减，可能是氨基酸氧化或脱氨，转化成其它氨基酸所致[17]。

表1 反复煮制过程扒鸡卤汤游离氨基酸含量(湿基)Table 1 Free amino acid contents on braised chicken brine during repeated braising(Wet matter)

续表

配制新汤UAA、SAA、BAA、OAA与FAA含量分别为0.27、0、0.57、0和0.85 mg/100 g;随着煮制次数的增加,扒鸡卤汤中游离氨基酸含量先急剧增加后渐趋平缓,煮制18次后,卤汤UAA、SAA、BAA和OAA含量与老汤无显著性差异(p>0.05),且FAA含量也与老汤无显著性差异(p>0.05)。老汤中UAA、SAA、BAA、OAA、FAA含量分别为30.13、72.12、101.91、0.99、205.14 mg/100 g,且UAA、SAA、BAA、OAA分别占FAA的14.69%、35.16%、49.68%、0.48%。原因可能是卤汤中游离氨基酸主要来源于两个方面:一是鸡肉在煮制过程中,肌肉组织蛋白水解酶、氨肽酶对鸡肉蛋白质(主要是肌浆蛋白)的降解作用生成游离氨基酸,二是煮制过程中使用的配料如香辛料等[18-19]。扒鸡的一个煮制循环为4 h左右,经过长时间的高温煮制后,扒鸡中的游离氨基酸较为充分地溶解进入卤汤。另外,扒鸡老汤为多年反复使用的老汤,每次煮制扒鸡后都会往卤汤中添加一定比例的香辛料、调味料等配料对汤汁进行复原配制。反复煮制后,扒鸡卤汤游离氨基酸含量不断升高,这与成亚斌等[19]研究结果一致。

2.2 核苷酸含量分析

2.2.1 色谱条件优化 由于5′-GMP和5′-IMP分子结构相似,保留时间接近,因而较难分离六种核苷酸。比较0.05 mol/L的不同pH磷酸二氢钠、磷酸氢二钠与磷酸二氢钾对六种核苷酸的分离效果,发现磷酸二氢钠与磷酸氢二钠混合溶液分离效果较差;另外,pH为4.3的磷酸二氢钾虽然分离效果较好,但是峰宽较大且严重拖尾,pH为6.5时,5′-GMP和5′-IMP两种物质出现叠峰现象,pH为5.4时,六种核苷酸很好地分开且无明显拖尾现象。

图1 核苷酸及其降解物标准品HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of standard nucleotides and related compounds

2.2.2 核苷酸及其降解产物 核苷酸及其降解产物的含量是一个动态变化过程,ADP脱去一个磷酸基团生成AMP,AMP脱去一个氨基生成IMP,而IMP最终降解为Hx和I[20]。反复煮制过程扒鸡卤汤核苷酸及其降解产物见表2,由表2可知,配制新汤中各种核苷酸含量很低,为0.40～3.43 mg/100 g,随着煮制次数的增加,煮制新汤呈味核苷酸(5′-IMP、5′-GMP和5′-AMP)、5′-ADP、I和Hx含量先增加后渐趋平缓,煮制15次后,风味核苷酸含量维持在21.28～23.03 mg/100 g的范围内变化。老汤中5′-GMP、5′-IMP、5′-ADP、Hx、5′-AMP、I及风味核苷酸含量分别为1.65、14.68、3.87、10.84、4.96、17.73及21.28 mg/100 g。显著性分析结果表明,煮制15次后,扒鸡卤汤整体无显著变化(p>0.05)。这可能是因为反复煮制后,扒鸡及香辛料中的呈味核苷酸进入卤汤中并不断累积,最后达到平衡状态;另外,呈味核苷酸在高温加热过程中分解,主要发生的是脱磷酸反应,加热时间较短时产生I,长时间加热会发生脱碱基反应,生成Hx[21]。对于呈味核苷酸,老汤中5′-IMP含量明显高于5′-GMP和5′-AMP含量,原因可能是扒鸡卤汤中肉汤比高于料汤比,而5′-IMP主要存在于动物性食品中,而5′-GMP是植物性食品中主要呈鲜物质,5′-AMP主要由ATP降解产生[18],这与唐春红等[22]的研究结果一致。

表2 反复煮制过程扒鸡卤汤核苷酸及其降解物含量(湿基)Table 2 Nucleotide contents on braised chicken brine during repeated braising(Wet matter)

2.3 卤汤滋味物质的呈味作用及鲜味强度评价

滋味物质对滋味的贡献不仅与其含量有关,还与其滋味阈值有关[23]。扒鸡卤汤呈味5′-核苷酸和游离氨基酸的含量、滋味特性、阈值[24-25]和滋味活性值见表3。由表3可知,扒鸡卤汤所有呈味5′-核苷酸和游离氨基酸TAV均小于1。其中,Lys的TAV最高,为0.94,其次是Glu,为0.74。Lioe等[26]研究发现低于呈味阈值的BAA,可增强其它氨基酸的鲜味和甜味。另外,BAA中Ile、Leu与Met阈值较低,Lys能参与一些风味物质反应,如与亚油酸甲酯反应形成Ala、Gly、Asp等化合物[27-28]。滋味不是由单一氨基酸或5′-核苷酸决定的,鲜味、甜味和苦味等游离氨基酸、5′-核苷酸的相互协同作用是决定卤汤滋味的关键因素[14,29-30]。

表3 扒鸡老汤滋味物质的含量(湿基)、滋味特征、阈值和滋味活性值Table 3 The contents(wet matter),taste attributes,taste thresholds and TAVs of taste compounds on aged

由图2可知,配制新汤的EUC为0.002 g MSG/100 g,反复煮制后,卤汤EUC先急剧升高后渐趋平缓,煮制12次后趋于稳定状态,含量为0.57 MSG/100 g(湿重),原因是煮制12次后,卤汤鲜味氨基酸和呈味核苷酸均趋于稳定状态。老汤EUC为0.56 g MSG/100 g(湿重),即1 g老汤的鲜味强度相当于0.0056 g MSG所提供的鲜度。MSG的滋味阈值为30 mg/100 mL,老汤EUC的TAV值为18.67,说明老汤有较为强烈的鲜味强度。

图2 反复卤煮过程扒鸡卤汤等鲜浓度Fig.2 Equivalent umami concentration on braised chicken brine during repeated braising

3 结论

通过对反复煮制过程扒鸡卤汤滋味呈味物质的跟踪分析发现,随着煮制次数的增加,煮制新汤中游离氨基酸与核苷酸含量先急剧增加后渐趋平缓,煮制18次后的卤汤UAA、SAA、BAA、OAA与FAA含量与老汤无显著性差异(p>0.05),煮制15次后的核苷酸含量与老汤无显著性差异(p>0.05),老汤中UAA、SAA、BAA、OAA、FAA含量分别为30.13、72.12、101.91、0.99、205.14 mg/100 g,5′-GMP、5′-IMP、5′-ADP、Hx、5′-AMP、I及风味核苷酸含量分别为1.65、14.68、3.87、10.84、4.96、17.73及21.28 mg/100 g,EUC的TAV值为18.67。

新汤逐渐演化为一个成分较为稳定的复杂多组分分散体系,虽然新汤中游离氨基酸、核苷酸含量及等鲜浓度达到平衡时的煮制次数有差异,但18次后达到稳定状态,新汤体系累积效应达到最大值,且与老汤基本接近。