廖良坤,张苏慧,周 伟,*,李积华,魏晓奕,崔丽虹,袁 源,王绥鑫,万明正

(1.中国热带农业科学院农产品加工研究所,广东湛江 524001； 2.农业部热带作物产品加工重点实验室,广东湛江 524001； 3.华中农业大学食品科技学院,湖北武汉 430070； 4.海南景和农业开发有限公司,海南海口 570100)

斜叶黄檀(Dalbergiapinnata(Lour.)prain.)主要产于广西、海南等地,可用于制作佛珠、手串以及精制精油等,属于降真香中的一个属[1]。在《本草纲目》[2]中有关于斜叶黄檀资料的记载,可以被用作熏香用的香料,也可以在战场上被用于治疗跌打损伤和刀伤等药材使用[3],因此斜叶黄檀兼具香药两方面的作用。斜叶黄檀作为降真香中的一种香料,目前有关斜叶黄檀的资料较少,多数曾将其降真香误认为降香,直到张丹雁[3]将其利用基因鉴定技术才得以鉴别。

精油是由多种成分所组成的混合物,目前关于植物精油功能活性的研究主要有抗氧化、抑菌、抗炎以及对酶活性的抑制等[1,4-14],其中研究最多的为抗氧化和抑菌。Sacchetti G等[15]比较了十一种不同精油的抗氧化活性,Saima Siddique等[16]通过琼脂扩散法和微量稀释法研究白千层木精油对食源性病菌的抑菌和杀菌作用。由于植物精油残留毒性和副作用小,因此近年来对不同精油的抑菌研究较多[17-20]。茶树精油被开发为药物和保健品,也被用作防腐剂和消毒剂等[21]。植物精油已有的抗氧化、抑菌等生物活性使得其备受关注,其应用领域也越来越广泛。

然而,目前关于斜叶黄檀的资料主要集中在品种鉴定及成分分析方面,而对斜叶黄檀精油功能活性方面的研究较少,赵维波等[22]采取水蒸气蒸馏法提取斜叶黄檀中的精油并研究其抗氧化活性。本文主要通过超临界CO2提取斜叶黄檀精油,测定其中多酚、黄酮的含量,并测定其体外抗氧化、抑菌能力以及抑制黑色素的形成能力,为斜叶黄檀精油的深入研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

斜叶黄檀精油 超临界CO2萃取得到[23];没食子酸标准品(纯度:HPLC≥98%)、芦丁标准品(纯度UV≥98%) 上海源叶生物科技有限公司;福林酚、DPPH、ABTS 美国Sigma公司;亚硝酸钠、磷酸氢二钠、酪氨酸酶 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;L-酪氨酸 上海麦克林生化科技有限公司;熊果苷(化妆品级) 青岛优索化学科技有限公司;硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、过硫酸钾、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸(TCA)、磷酸钠、钼酸铵、三氯化铁、硫酸、碳酸钠、二叔丁基对甲苯(BHT) 均为国产分析纯;测试菌种包括2株革兰氏阳性菌:金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25923)、化脓性链球菌(StreptococcusATCC 19615);3株革兰氏阴性菌,大肠杆菌(EscherichiacoliCMCC(B)44103)、铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC 27853)、鼠伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphimuriumATCC 14028);1株真菌,白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 10231) 其中大肠杆菌来源于广东环凯微生物科技有限公司,其他五株菌均来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心;牛肉粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、酵母粉、葡萄糖、碳酸氢钠、氯化钠、麦芽糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、胰蛋白胨 国产生化级。

UV-1780紫外可见分光光度计 岛津仪器(苏州)有限公司;垂直流超净工作台 上海智城分析仪器制造有限公司;Shimadzu QP2010-Plus气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司;全自动高压蒸汽灭菌器、pH计、离心机、恒温振荡培养箱 中国热带农业科学院农产品加工研究所。

1.2 实验方法

1.2.2 多酚含量的测定 参照国标法测定多酚含量[24]。具体操作如下:配制浓度为1 mg/mL的没食子酸溶液,分别取配制好的没食子酸溶液0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于10 mL容量瓶中用蒸馏水定容。分别取上述稀释后的没食子酸溶液各2 mL于50 mL容量瓶,再依次加10 mL 10%福林酚试剂,8 mL 7% Na2CO3溶液,室温下放置1 h,用蒸馏水定容至刻度线后于765 nm处测定吸光度值。以不同浓度没食子酸为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

样品处理:将待测样品用无水乙醇适度稀释后取2 mL于50 mL容量瓶中,同样加10 mL 10%福林酚试剂,8 mL 7% Na2CO3溶液,室温下放置1 h后,用蒸馏水定容后于765 nm处测定吸光度值。根据标准曲线,得到多酚含量。

1.2.3 黄酮含量的测定 对Behnaz Tohidi等[25]方法稍作修改。具体操作方法如下:配制浓度为0.24 mg/mL的芦丁溶液,分别取0.24 mg/mL芦丁溶液0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于10 mL容量瓶,加入50 mg/mL NaNO2溶液0.5 mL,摇匀后放置6 min,再加入100 mg/mL Al(NO3)3溶液0.5 mL,摇匀后放置6 min,加入40 mg/mL NaOH溶液4 mL,最后用蒸馏水定容,摇匀后在室温下放置15 min后于波长为510 nm处测定吸光度值,以芦丁浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

样品处理:取适度稀释后的待测样品于10 mL容量瓶,加入50 mg/mL NaNO2溶液0.5 mL,摇匀后放置6 min,再加入100 mg/mL Al(NO3)3溶液0.5 mL,摇匀后放置6 min,加入40 mg/mL NaOH溶液4 mL,最后用蒸馏水定容,摇匀后在室温放置15 min后于波长为510 nm处测定吸光度值。根据标准曲线,得到黄酮含量。

1.2.4 抗氧化活性的测定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的测定 参考Hu等[26]的方法,操作如下:配制浓度为0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液,贮存于棕色瓶中备用。用无水乙醇将精油配制成不同浓度(0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mg/mL),取不同浓度精油待测液2 mL,加入DPPH乙醇溶液2 mL,混合均匀,放置室温下于暗处反应30 min,测定517 nm处的吸光度值A1;另取试管加入2 mL乙醇溶液和2 mL DPPH乙醇溶液,测定517 nm处吸光度A2;取不同浓度待测液2 mL,各加入2 mL乙醇溶液,测定517 nm处吸光度A0;平行3次试验取平均值。按上述条件,用不同浓度BHT(0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mg/mL)做阳性对照。按公式计算DPPH自由基清除率。

关小美1986年6月出生于洛阳市某县，家境富裕。2008年从洛阳市某大学毕业后，被安排到某企业做行政工作，单位还给她分了一间单身宿舍，工作轻松又体面。

式(1)

1.2.4.2 ABTS自由基清除能力的测定 参考Miller等[27]的方法,ABTS待用液的配制如下:分别配制7 mmol/L的ABTS溶液和2.4 mmol/L过硫酸钾溶液,将两者等体积混合均匀后倒进棕色的玻璃瓶里,室温下暗处反应12～16 h形成ABTS待用液。用无水乙醇稀释到在734 nm处吸光度值为0.7±0.02。ABTS清除能力测定的具体操作为:配制不同浓度的精油待测样品(0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mg/mL),分别取不同浓度待测样品2 mL,在反应体系中加入4 mL ABTS溶液,在734 nm处测定放于暗处反应20 min后的吸光度值AA,同时用水代替样品做空白对照的吸光度值为Ac。用同浓度的BHT做阳性对照。

ABTS自由基清除率(%)=[(Ac-AA)/Ac]×100

式(2)

1.2.4.3 总还原力的测定 参考李顺峰等[28]方法,将待测的不同浓度精油(0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18 mg/mL)各吸取1 mL于试管中,分别加入1.5 mL磷酸盐缓冲液(PBS,pH=6.6 0.2 mol/L)、1.5 mL质量分数为1%的铁氰化钾(K3Fe(CN)6),混匀后于50 ℃恒温水浴中反应20 min,冷却至室温后各加入1.5 mL质量分数为10%的TCA,充分混匀后在离心机中以4000 r/min离心10 min,取上清液2.5 mL、加入0.5 mL新配制的质量分数为0.1%的三氯化铁溶液和2 mL蒸馏水,在常温下充分混匀后在波长为700 nm处测定各个试管中样品的吸光度值。用同浓度的BHT做阳性对照。

1.2.4.4 总抗氧化能力的测定 采用磷钼络合法测定精油的总抗氧化能力[29]。将待测精油用无水乙醇溶解后配成不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL),吸取1 mL于试管中,依次加入已配制好的浓度分别为0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L磷酸钠和4 mmol/L的钼酸铵各1 mL,在常温下充分摇荡均匀后在95 ℃的水浴锅中水浴1.5 h,后取出冷却至室温,于695 nm处测定吸光度值,阳性对照BHT做同样处理。

1.2.5 抑菌活性的测定 该实验选取两株革兰氏阳性菌,三株革兰氏阴性菌和一株真菌作为待测菌株,测定斜叶黄檀精油对六株菌的抑菌圈直径以及最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。具体操作如下:

1.2.5.1 抑菌圈的测定 参考刘晓生等[30]法,并加以修改。具体操作如下:将培养至对数生长期的菌原液取200 μL在已凝固的固体培养基上,涂布均匀后在上方均匀对称放置三张滤纸片(直径为6 mm),取待测精油5 μL加在滤纸片上,在37 ℃下培养24 h,通过测量抑菌区域的直径判断精油的抑菌活性,每次实验重复三次。抑菌圈实验测定标准为:抑菌圈大于20 mm,极敏;15～20 mm,高敏;10～15 mm,中敏;7～10 mm,低敏;小于7 mm,不敏感。

1.2.5.2 MIC和MBC的测定 用肉汤稀释法(二倍稀释法)测定精油的MIC和MBC。用吐温80将精油配成不同浓度(1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 μL/mL),在各试管中依次加入8.9 mL培养基、0.1 mL菌悬液、1 mL不同浓度精油,最终精油浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125 μL/mL,24 h后观察细菌生长情况,无明显浑浊的最小浓度为MIC,取无明显菌落生长的试管,挑取后平板划线,24 h后仍无菌落生长的为MBC。

1.2.6 抑制酪氨酸酶活性的测定 参考Baurin N等[31]方法并做修改,具体操作如下:依次配制如下试剂:磷酸盐缓冲液(pH=6.8,0.2 mol/L磷酸二氢钠,0.2 mol/L磷酸氢二钠)、L-酪氨酸溶液(1.5 mmol/L)、酪氨酸酶溶液(酶活:50 U/mL)、样品(用甲醇配制浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL),用同浓度的熊果苷做阳性对照。

在反应体系中依次按如表1加入磷酸盐缓冲液、不同浓度待测样品、酪氨酸酶,30 ℃水浴10 min后,向反应体系中加入L-酪氨酸溶液,反应20 min后在475 nm处吸光度值。

表1 抑制酪氨酸酶活性实验各物质添加顺序Table 1 The order of adding substance tyrosinase activity inhibition experiment

抑制率(%)=[(A-B)/A]×100

式(3)

式中：A-标准对照吸光度值;B-待测物吸光度值。

1.3 数据处理

化合物采用峰面积归一化法进行计算,实验结果以平均值±标准偏差(SD)表示,以Origin 8.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 精油中挥发性成分分析

表2为经超临界CO2提取得到的精油中主要成分,其中榄香素所占比例高达75.54%,威士忌内酯、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚和甲基丁香酚所占百分含量分别为0.47%、1.27%和2.35%。而赵维波等[22]采用水蒸气蒸馏法提取得到的挥发油中的榄香素、威士忌内酯、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚和甲基丁香酚的含量分别为:89.74%、0.41%、0%和2.67%。此外后者挥发油类还含有水杨醛、芳樟醇等成分,在本实验中并未得到此类挥发性成分,可能是原料来源不同或者仪器参数等的差别,使得提取得到的精油挥发性成分存在差异性。在精油中所检测到的成分中,榄香素主要有较强的催眠作用、抗蚊杀虫及抗真菌、抗肺炎等作用[32],甲基丁香酚具有降压、抗氧化、抑菌等作用[33],4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚具有抑制脂质过氧化的作用,以及清除自由基等抗氧化作用[34],威士忌内酯具有较强的抑菌、抗炎及抗氧化等作用,可用于糖果、饼干等各类食品的食用香料[22]。鉴于主要成分本身具有的特殊功能活性,故而对精油的总体功能活性进行评价。

表2 斜叶黄檀精油挥发性成分分析Table 2 Analysis of volatile constituents of essential oil from Dalbergia pinnata

2.2 精油中多酚含量测定结果

经测定多酚标曲为y=0.0846x+0.0194,R2=0.9993,斜叶黄檀精油中多酚含量为95.52 μg没食子酸当量/mg精油,含量为9.552%。与其他植物精油相比,含量相对较高,周海旭[35]在用无水乙醇作为提取溶剂且在最优条件下提取樟树中的多酚,得到的多酚得率为5.41%,以及Abdelwahab S I等[36]通过水蒸气蒸馏法提取得到的樟树中精油的多酚含量为5.04%。多酚含量均小于本实验提取得到的多酚含量。

2.3 精油中黄酮含量测定结果

绘制的标准曲线为y=12.084x-0.0124,R2=0.9993,斜叶黄檀中黄酮含量为0.0913 mg芦丁/mg精油,即黄酮含量百分比为9.13%。与其他植物精油相比,含量也存在差异性,经查阅相关文献麝香草中T.fallax中黄酮含量为8.14%,T.vulgaris中黄酮含量为8.55%[37],要低于本实验所提取得到的精油中的黄酮含量。

2.4 抗氧化活性分析

2.4.1 精油对DPPH自由基清除能力的影响 斜叶黄檀精油对DPPH自由基清除能力的影响见图1。随着精油浓度的升高,其对DPPH自由基的清除能力也逐渐增大,斜叶黄檀精油与DPPH自由基清除能力呈现出较好的量效关系。本研究中精油浓度为0.18 mg/mL时,清除率为70%左右,而赵维波等[22]通过水蒸气蒸馏提取得到的挥发油在清除率为70%左右时,其精油浓度为16 mg/mL。说明斜叶黄檀精油对DPPH自由基具有较强的清除能力,提取方法的不同使得精油对DPPH自由基的清除能力存在差异。此外精油与阳性对照BHT相比,其DPPH自由基清除能力弱于阳性对照,且与阳性对照存在较大差异,随着浓度的升高,差异逐渐减小。

图1 斜叶黄檀精油对DPPH自由基清除能力的影响Fig.1 Effect of free scavenging activity of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil on DPPH radical

2.4.2 精油对ABTS自由基清除能力的影响 图2为斜叶黄檀精油对ABTS自由基清除能力的影响。斜叶黄檀精油对ABTS自由基的清除能力随着浓度的增大而增强,呈现较好的量效关系。在相同浓度下,其清除能力要弱于阳性对照BHT。在浓度为0.18 mg/mL时,对ABTS自由基的清除能力达80%以上,可见其对ABTS自由基的清除能力较强。

图2 斜叶黄檀精油对ABTS自由基清除能力的影响Fig.2 Effect of free scavenging activity of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil on ABTS radical

2.4.3 精油对总还原力的影响 图3为斜叶黄檀精油对总还原力的影响,斜叶黄檀精油的总还原力值与浓度关系密切,随着浓度的增高,总还原力值也随之增加,呈现出良好的正相关性。但与阳性对照相比,仍较低,阳性对照在浓度为0.12 mg/mL时总还原力值就达0.8以上,而斜叶黄檀精油仅有0.4左右。

图3 斜叶黄檀精油对总还原能力的影响Fig.3 Effect of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil on the total reducing power

2.4.4 精油对总抗氧化能力的影响 图4为斜叶黄檀精油对总抗氧化能力的影响,与阳性对照BHT对比,总抗氧化能力相对较弱,在精油浓度为1 mg/mL为总抗氧化值达到0.4,而同浓度的阳性对照BHT的总抗氧化值达到0.7以上。总抗氧化能力随着精油浓度的增加而呈现较好的正相关性。

图4 斜叶黄檀精油对总抗氧化能力的影响Fig.4 Effect of the total antioxidant capacity of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil

2.5 精油的抑菌结果

表3为斜叶黄檀精油对不同测试菌的抑菌能力大小,从表3中抑菌直径结果可以看出,斜叶黄檀精油对金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌以及白色念珠菌均为中敏程度。但对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌三株革兰氏阴性菌无明显的抑菌效果。故而可以判断斜叶黄檀精油具有抑制革兰氏阳性菌和真菌的活性。

表3 斜叶黄檀精油的抑菌结果Table 3 The results of bacteriostasia of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil

针对斜叶黄檀精油具有的抑制革兰氏阳性菌和真菌的作用,测定其MIC和MBC,值越小表明抑菌性越强,可见斜叶黄檀精油对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC值最小,对其抑菌性最为明显。对化脓性链球菌的MIC和MBC值次之,而金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌均是存在于人体表面的细菌,因精油具有明显的抑菌效果，可以扩大精油的应用范围。

2.6 精油对酪氨酸酶抑制率的影响

图5为精油和阳性对照熊果苷对酪氨酸酶的抑制率结果。随着精油浓度的升高,精油对酪氨酸酶的抑制率存在着正相关性。斜叶黄檀精油与阳性对照熊果苷均有强的抑制酪氨酸酶活性,进而抑制黑色素的形成,且精油对酪氨酸酶的抑制活性强于阳性对照熊果苷。间接证明了斜叶黄檀精油具有抑制黑色素形成的能力。故而为斜叶黄檀精油的广泛应用提供理论依据。

图5 斜叶黄檀精油抑制酪氨酸酶活性Fig.5 The inhibition activity of Dalbergia pinnata(Lour.)Prain. essential oil on tyrosinase

3 结论

本文较为系统的研究了斜叶黄檀精油中的多酚、黄酮含量以及精油的抗氧化、抑菌和抑制黑色素形成能力的功能活性,结果证明该精油具有较好的清除DPPH和ABTS自由基能力,较强的总还原力以及总抗氧化能力,综合证明该精油具有较强的抗氧化活性;对革兰氏阳性菌(G+,主要是金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌)以及真菌具有较好的抑制活性,以及具有抑制酪氨酸酶活性的功效,从而抑制黑色素的形成。精油是由多种成分组成的复杂体系,其具有多方面的功能活性是多种复杂成分共同作用的结果,本研究结果为精油的深入研究以及在应用方面提供一定的理论依据,也为开发更多产品提供一定的参考价值。