杨静慧，周旖旎，黄唯子，刘艳军，吴楠，卢云慧



青睐苜蓿耐盐突变体愈伤组织过氧化物同工酶特性分析

杨静慧1a,1b，周旖旎1a，黄唯子1a，刘艳军1a，1b，吴楠1c，卢云慧2

（1. 天津农学院 a. 园艺园林学院，b. 植物组织培养工程技术和诱变育种中心，c. 工程技术学院，天津 300384； 2. 天津绿茵景观生态建设股份有限公司，天津 300384）

苜蓿是一种高经济价值作物，为了解其耐盐突变体愈伤组织与普通愈伤组织的差异，以突变体与对照为材料，对突变体两个生长阶段的过氧化物同工酶特性进行比较，分析同工酶带型及同工酶各条带过氧化物酶的含量。结果表明：对照苜蓿的两个重复均出现7条酶带p1～p7，耐盐突变体出现5条谱带，缺失的酶带迁移率分别是0.430和0.733。酶谱的相似性系数为0.833。突变体绿色愈伤的主带谱带p1（0.147）、p2（0.263）和p7（0.864）的着色色度和带宽与对照基本相同。说明主要基因一致。各酶带活性分析显示，除p2酶带外，5条共有的酶带中，均为突变体黄色愈伤的酶含量最低。对照苜蓿中迁移率小的p1和p3酶带含量最高，突变体绿色愈伤迁移率大的p4、p7酶含量最高。同工酶总含量中，对照苜蓿最高（56.645 0 mg/mL），突变体绿色愈伤居中（49.653 0 mg/mL），突变体黄色愈伤组织最少（42.806 0 mg/mL）。总之，耐盐苜蓿突变体的过氧化物酶种类和含量的减少说明发生了基因遗传背景上的变异。

苜蓿；耐盐；突变体；愈伤组织；过氧化物同工酶

苜蓿（L.）作为豆科苜蓿属多年生草本，是世界上最重要、种植面积最广的豆科牧草之一，因其适应性广、产草量高，且富含蛋白质、维生素和矿物质等营养物质，被誉为“牧草之王”，是优良的饲料与绿肥[1]。近年来，我国畜牧业尤其是奶业发展迅速，对苜蓿的需求量日益增加，但我国苜蓿的产量和品质远不能满足市场需要，苜蓿产业面临着严峻挑战[2]。我国人口众多，土壤紧张，又有较大面积的盐碱地，盐碱地面积约4 000万hm2，约占陆地面积的25%，仅海岸带、滩涂就在667万hm2以上[3]。天津也有大片的盐碱地，大多数苜蓿品种能够在其轻度盐碱地如静海、西青等地区栽培。

广泛存在于植物体内的过氧化物同工酶是植物适应环境变化并作出灵敏反应的一类酶, 常被认为是植物对逆境环境抗逆作用大小的标志，是一种重要的遗传标记[4-5]，同工酶是催化反应相同而结构及理化性质不同的一组酶，几乎存在于所有生物的所有组织中[6-7]。同工酶从遗传学角度可分为4类：①单基因决定的同工酶；②多基因决定的同工酶；③复等位基因决定的同工酶；④修饰同工酶或次生同工酶。同工酶在植物系统学研究中已有广泛应用，用于研究植物间的亲缘关系，并获得了较为准确的结果[8-11]。如以酶距作为种属间酶谱分析的数量化指标，采用排序法对其亲缘关系进行比较分析[12]。研究显示在高等植物的生长发育过程中，同工酶的多种分子形式具有阶段特异性和组织特异性[13]。

植物过氧化物同工酶的多寡和有无与植物不同发育时期有密切关系。水稻（）、高粱、小麦（）和长穗堰麦草种子在萌动以前，过氧化物同工酶很少, 待幼芽长到0.5～1 cm 以后，过氧化物酶才得到充分的表达[14]。靳月华等[15]研究发现，生长在长白山高山苔原带的圆叶柳（）和长圆叶柳（）比垂柳等其他4种普通柳树分别多了7 条和5 条新的同工酶谱带, 这正是适应高山恶劣生态条件的生理调节功能和遗传基础。邹春静等[13]认为，酶带的变异往往表现在非标志带上, 造成它在酶带数目及迁移率上存在差异（质的差异）或酶相对活性上不同（量的差异）。

过氧化物同工酶对环境反应很灵敏[16-17]。污染区植物的过氧化物同工酶含量增高, 酶带增多, 酶活性增强；并且酶带数目、酶含量、酶活性等变化幅度小的过氧化物同工酶抗空气污染能力强[4]。在盐胁迫下，耐盐水稻在经过10 g/L Nacl 胁迫后，过氧化物同工酶增加，而对盐敏感的水稻侧根系内过氧化物同工酶减少[18]。一般耐盐与正常品种根内过氧化物同工酶比较稳定或略有减少现象。过氧化物同工酶的变化与植物耐盐与盐敏感特性存在一定的相关性[13]。

本研究以青睐苜蓿对照和耐盐突变体为试材，采用非变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）方法检测两者过氧化物同工酶的特性，为突变体的鉴定等提供依据。

1 材料与方法

青睐苜蓿愈伤组织和青睐苜蓿耐盐突变体愈伤组织由天津农学院园林植物教研室提供。

试验于2017年3月9日进行，取青睐苜蓿愈伤组织为对照，青睐苜蓿耐盐突变体绿色愈伤组织和黄色愈伤组织为两个处理。

愈伤组织培养方法：愈伤组织培养按照杨静慧等[20]的方法。

同工酶电泳方法：采用非变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE），参照张东向等[21]的方法，并略作改动。分离胶浓度为8%，pH 8.8；浓缩胶浓度为4%，pH 6.8。电极缓冲液为Tris-甘氨酸系统（pH 8.0）。点样量为10 μL。过氧化物酶染色采用联苯胺染色法。

1.1 制备样品

将3种愈伤组织分别加入2 mL离心管中，每种颜色0.3 g，各加入1 mL的pH为8.0的提取液，放入高通量组织研磨仪中研磨1 min，频率为26 Hz。研磨后取出离心管中的小钢珠，放入台式高速冷冻离心机中离心10 min，转速为12 000 r/min，温度为4 ℃。离心后用微量移液器各取出上清液，加入到新的离心管中。

1.2 点样

每样品取7 μL，各加入3 μL蔗糖溶液和0.5 μL溴酚蓝，混合后用微量移液器缓慢滴入胶片的凹槽中，1个对照，2个处理，每处理重复 3次。

1.3 电泳

电泳的初始电压为80 V，待样品到达分离胶和浓缩胶分界线时改为120 V。等样品到达距离底部1 cm时结束电泳。

随现代信息和经济全球化的快速发展，中国的音乐产业经历了从传统唱片产业到数字产业的转变。根据中国音乐产业现阶段的发展状态来看，笔者将音乐产业分为两种类型：以盈利性为主的音乐活动、非盈利性的音乐活动。

2 结果与分析

2.1 耐盐突变体苜蓿与对照苜蓿过氧化物同工酶带型分析

图1和图2显示，对照苜蓿和耐盐突变体苜蓿表现出的带型不同。对照苜蓿（CK）的两个重复均显示出现7条酶带（p1～p7），它们的迁移率（）依次是0.147、0.263、0.369、0.399、0.430、0.733和0.864；耐盐突变体苜蓿均只有5条带，分别是p1、p2、p3、p4和p7。比对照少了两条 酶带，缺失的是p5和p6。酶谱的相似性系数为0.833。

比较耐盐突变体愈伤组织和对照的同工酶，发现主带谱带（p1，p2和p7）的着色色度和带宽基本相同。

图1 耐盐突变体苜蓿与对照苜蓿愈伤组织过氧化物同工酶电泳图谱

图2 耐盐突变体苜蓿与对照苜蓿愈伤组织过氧化物同工酶酶谱模式图

2.2 耐盐突变体苜蓿与对照苜蓿愈伤组织过氧化物同工酶酶活性分析

各酶带的颜色深浅和带宽不同，即酶活性不同，详见表1。p1酶带：对照最高，达到12.967 0 mg/mL，高于耐盐突变体，两个突变体差异不大。p2酶带：黄色愈伤突变体最高，为9.928 5 mg/mL，其次是绿色愈伤突变体，为9.748 3 mg/mL，对照最低，只有8.011 2 mg/mL。p3酶带：对照＞绿色愈伤突变体＞黄色愈伤突变体。p4酶带：绿色愈伤突变体略大于对照，对照高于黄色愈伤愈伤组织。p7酶带：绿色愈伤突变体＞对照＞黄色愈伤突变体。总之，除p2酶带外，5条共有的酶带中，均为黄色愈伤突变体的酶含量最低。p1酶带和p3酶带两个迁移率小的酶带中对照苜蓿的酶含量最高，其余的p4、p7两个迁移率大的酶带中绿色愈伤突变体最高。

表1 耐盐突变体苜蓿与对照苜蓿愈伤组织过氧化物酶含量分析 mg/mL

如表1所示，对照组与绿色、黄色愈伤组织各酶带的差异显著性分析看出，p1条带绿色和黄色愈伤组织酶含量极显著低于对照组，两种突变愈伤组织间无显著差异，p2条带绿色和黄色愈伤组织酶含量极显著高于对照组，p3和p4条带中，黄色愈伤组织与绿色愈伤组织以及对照组有极显著差异，绿色愈伤组织与对照组差异不显著；p7条带中酶总量对照组、绿色愈伤组织、黄色愈伤组织之间两两均有着极显著的差异。

2.3 耐盐突变体苜蓿与对照苜蓿愈伤组织过氧化物同工酶总含量比较

图3所示，耐盐突变体苜蓿与对照苜蓿愈伤组织过氧化物同工酶总含量不同。表现为对照苜蓿最高、突变体绿色愈伤组织居中，突变体黄色愈伤组织最少。其中对照苜蓿的过氧化物同工酶含量为56.645 0 mg/mL，突变体绿色愈伤组织为49.653 0 mg/mL，突变体黄色愈伤组织为42.806 0 mg/mL。

在正常条件下，耐盐种类酶带数量少的结果与邹春静的研究一致，她认为正常品种根内过氧化物同工酶比较稳定或略有减少现象。过氧化物同工酶的变化与植物耐盐与盐敏感特性存在一定的相关性[13]。

图3 耐盐突变体苜蓿与对照苜蓿愈伤组织过氧化物同工酶总含量

2.4 耐盐突变体愈伤组织不同发育时期过氧化物同工酶带型和含量分析

如图1和图2所示，苜蓿耐盐突变体绿色愈伤组织的过氧化物同工酶带型和其黄色愈伤组织均有5条带，说明其遗传特性完全一致。绿色愈伤组织生长到一定时期，细胞失绿、生长衰弱、老化，因而变成黄色。这样发育到两个阶段的愈伤组织同工酶并未出现差异，表现出遗传上的稳定性，这也是许多学者用同工酶研究植物的亲缘关系的原因[8-11]。

但是，发育到不同阶段的组织，同工酶含量有不同的变化[14]。本研究中过氧化物同工酶的数量随组织的衰老而减少。这与陈燕珍等[22]的研究一致。即同一植株不同部位的HLP同工酶活性存在差异，中部成熟叶的酶活性（6.89×103U/g）＞底部衰老叶的酶活性（5.38×103U/g）。所以，可以用同工酶数量或活性衡量植物的生长状态。

在绿色愈伤组织和黄色愈伤组织中，迁移率不同的酶带，其过氧化物酶含量也不同。在黄色愈伤组织中迁移率低的酶带（如p1和p2）含量高，迁移率高的酶带中，绿色愈伤植物的含量高。换句话说，衰老的组织中过氧化物同工酶迁移率高的酶含量高，新鲜组织中迁移率低的同工酶含量高，见图4。

图4 苜蓿耐盐突变体愈伤组织不同阶段过氧化物同工酶含量

3 讨论

逆境对植物的影响通常表现在多个方面，其中活性氧的清除系统是植物适应逆境的常见调节系统。通常情况下，逆境能够破坏植物自身的代谢平衡，使活性氧含量上升，从而使细胞氧化作用加剧，进一步破坏植物组织。当植物感受到逆境时，增强活性氧清除系统的功能，维持植物体内的代谢平衡。在本试验中，两种苜蓿耐盐突变体材料与对照组相比，过氧化物同工酶的总量以及条带数均下降，这一现象可能由于本身的基因突变造成。由于耐盐突变体是经过高盐环境的筛选而得到，其适应盐胁迫的机理不得而知，因此对于这一现象的解释需要进一步探究。

4 结论

通过对苜蓿耐盐突变体与对照组在过氧化物同工酶角度的对比，发现耐盐苜蓿突变体的过氧化物同工酶总量小于对照组，且同工酶带型与对照组相比少了两个条带，推测其发生了遗传背景上的变异。

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责任编辑：杨霞

Analysis of peroxidase isoenzymes characteristics in salt-tolerant callus of alfalfa mutants

YANG Jing-hui1a,1b，ZHOU Yi-ni1a, HUANG Wei-zi1a, LIU Yan-jun1a,1b, WU Nan1c, LU Yun-hui2

（1. Tianjin Agricultural University a. College of Horticulture and Landscape, b. Engineering Technology Center for Plant Tissue Culture and Mutation Breeding, c. College of Engineering and Technology, Tianjin 300384, China；2. Tianjin LÜYIN Landscape and Ecology Construction Co., Ltd, Tianjin 300384, China）

Alfalfa is a kind of high economic value crop. In order to understand the differences between salt-tolerant mutant callus (ST mutant) and common variety callus (CK) of alfalfa, the characteristics of peroxidase isoenzymes type and the content of isozyme were compared between the CK and ST mutant in two development stages of the mutant callus. The results showed that there were seven zymogram bands(p1-p7) in the CK, while there were only five zymogram bands in ST mutant with lack of two bands in0.430 and0.733. The similarity coefficient of the zymogram was 0.833. The chromaticity and band width of the main isoenzyme bands p1 (0.147), p2 (0.263) and p7 (0.864) of green ST mutant callus were similar with that of CK. It indicated that their major genes were consistent. The analysis of isoenzyme activity showed that the isoenzyme content of yellow ST mutant callus was the lowest in 5 common isoenzyme bands except for p2 band. The content of p1 and p3 bands with short mobility was the highest in CK, while the content of p4 and p7 with large mobility was the highest in green ST mutant. The total content of isoenzymes was the highest (56.645 0 mg/mL) in CK, green ST Mutant was in the midium (49.653 0 mg/mL) and yellow ST mutant was the least in (42.806 0 mg/mL). In conclusion, the less isoenzyme bands of ST mutant indicated a variation in the genetic background.

alfalfa; salt tolerance; mutant; callus; peroxidase isoenzymes

1008-5394（2018）03-0029-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.03.006

S541.9

A

2017-03-24

天津市农委项目（201502100）；天津市科委项目（16YFZCNC00750，15PTSYJC00130）

杨静慧（1961 -），女，教授，博士，主要从事园艺植物栽培、抗逆生理和分子育种研究。E-mail：jinghuiyang2@aliyun.com。