郑耀通, 李文燕

(1.福建农林大学 资源与环境学院，福建 福州 350002；2.福建农林大学 应用微生物技术研究所，福建 福州 350002)

白腐菌产生的木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)是木质素降解的关键酶，在木质素及其结构类似物的降解中起重要作用，木质素酶的合成是由培养基中碳、氮饥饿触发的次生代谢过程，因而其产酶量低且不稳定[1-3],了解白腐菌抗营养阻遏产酶机理是提高酶产量的关键。Lac是一种含铜多酚的氧化酶，比LiP、MnP等过氧化物酶应用更广泛[4]，Lac可与多种底物作用[5]，除降解木质素外还在生物检测[6]、生物制浆与漂白[7]、污染治理[8]等方面得到应用，了解白腐菌模式种黄孢原毛平革菌(Phanerochaete.chrysosporium)产Lac特性具有特别重要的意义。自Srinivasan等[9]以纤维素代替葡萄糖培养P.chrysosporiumBKM-F-1797产生Lac到Gnanamani等[10]发现硫酸铜可使P.chrysosporium以葡萄糖为碳源产生Lac并用光谱、磁共振与凝胶电泳证实P.chrysosporiumNCIM 1197能产生两种组成型Lac同工酶以来，P.chrysosporium产Lac日益受到重视，Prabu等[11]从多年灌溉制浆与造纸污水的土壤中分离到P.chrysosporiumTL1，可在纤维二糖-天冬酰胺介质中产生分子量为65 kDa的Lac，其基因序列与Trametesvillosalcc2(L49377)、Pycnoporuscinnarinuslac1基因(AF170093)分别具有85%的相似性。Buddolla等[12]从不同环境中分离到产Lac的P.chrysosporium；Jhadav等[13]对NCIM 1197深层发酵产Lac碳源条件进行了优化并部分纯化了Lac，发现其分子量大约66 kDa。国内对P.chrysosporium产Lac研究也受到重视，董旭杰等[14]发现P.chrysosporium5.0776在不同的培养条件下均能产生Lac；段新源等[15]发现P.chrysosporium在摇床培养条件下可产极少量的Lac；Gao等[16]发现P.chrysosporiumBKM-F-1767在限氮且初始C/N=100∶8条件下可产生20 U/L的 Lac。本研究筛选到2株解除营养阻遏在初生代谢产3种木质素酶的突变菌株[17-18]，并对P.chrysosporiumR5305在不同营养条件下的产Lac动力学研究时发现，在任一营养条件下均在培养前后出现两个产Lac高峰，推测可能是由产酶不同调控因子调控产生的不同同工酶造成，为验证这种可能，本研究利用这两株抗营养阻遏产木质素酶突变菌株，通过比较在富氮条件下不同时间产生Lac同工酶的差异，分析同工酶的产生与碳氮营养消耗的相关性，揭示黄孢原毛平革菌Lac同工酶产生机制及其与碳氮营养调控的关系，为白腐菌模式菌种木质素酶合成调控的深入研究及实际应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 以黄孢原毛平革菌野生型pc530(Phanerochaetechrysosporium,pc530)为出发菌株，经诱变选育的解除营养阻遏产酶菌株pcR5305、pcR5324，由福建农林大学应用微生物技术研究所提供。

1.1.2 培养基 ①PDA固体培养基,用于菌种扩大培养；②液体富营养培养基(g/L)：在Tien等[1](1983)经典培养基基础上改进，葡萄糖10，酒石酸铵 2.2，酒石酸钠0.28，CaCl20.01，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.05，CuSO4·5H2O 0.125，5 mg/L VB11 mL，无机盐溶液1 mL，用0.1 mol/L HAc-NaAc缓冲液调节至pH 4.5，用于液体产酶培养。无机盐溶液(g/L)：甘氨酸 1.5，FeSO4·7H2O 0.1，MgSO4·7H2O 3.0，NaCl 1.0，CoSO40.1，CaCl20.082，ZnSO40.1，CuSO4·5H2O 0.01，H3BO30.01，AlK(SO4)20.01，NaMoO40.01。

1.1.3 主要试剂 3,5-二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylicacid,DNS),2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、乙酸钠、酒石酸铵、乙酸、蒽酮、过硫酸铵、丙烯酰铵、愈创木酚、碘化钾和碘化汞等。DNS 和ABTS 购自Sigma 公司,其余试剂均为国产分析纯。

1.1.4 仪器与设备 超净工作台(VS-1300U,苏州净化设备有限公司);生化培养箱(SPX-520B-Z,上海博迅);电泳仪(DYY-12C,北京六一仪器厂);紫外可见光分光光度计(UV-1200,上海美谱达);高速冷冻离心机(GL-20G-II，上海安亭)等。

1.2 方法

1.2.1 培养方法与粗酶液制备 将上述液体培养基接种相应的菌株到装有30 mL培养液的300 mL三角瓶中，3个重复，37 ℃恒温静置培养，每天取1瓶发酵液过滤，80 ℃烘干至恒重，称量并计算菌体生物量。滤液经9 300×g，4 ℃离心5 min后制成粗酶液用于酶活测定。

1.2.2 Lac活性测定 在3 mL反应体系中，含粗酶液0.5 mL、pH 5.0的 0.1 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液1.5 mL、H2O2酶60 U，用1 mL 0.5 mmol/L ABTS启动反应，25 ℃水浴保温5 min，分光光度计在420 nm处测定吸光度随时间的变化。1个酶活力单位(U)以每分钟催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量表示。

1.2.3 氨氮与葡萄糖浓度测定 采用纳氏试剂比色法测定氨氮[19]，DNS试剂比色法测定葡萄糖浓度[20]。

1.2.4 Native-PAGE凝胶电泳 主要参考文献[21]的方法进行电泳，分离同工酶。方法如下：用4 ℃冰箱保存的全过程粗酶液进行聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离Lac同工酶。用10%的分离胶和5%浓缩胶溶液制备成PAGE凝胶，将需分析的粗酶液与PAGE样品缓冲液按4∶1的体积混合，用微量进样器吸取该混合液分别顺序加样20～30 μL至样品槽中。电泳条件：恒温4～8 ℃，电压200 V，电流20 mA，电功率40 W，电泳至溴酚蓝指示剂距离下端约1 cm处时，停止电泳，取出凝胶，蒸馏水冲洗2～3次后加入愈创木酚染色液，37 ℃恒温箱内染色约1 h，待酶带呈现较为清晰的红褐色时停止染色，取出凝胶漂洗干净，进行酶带分析。

2 结果与分析

2.1 突变菌株在富营养条件下产Lac同工酶动态分析

前期的研究发现，在富氮条件下，野生型黄孢原毛平革菌pc530(WT)仅在营养基本耗尽的次生代谢过程中产生极其微量的Lac,而突变菌株pcR5305、pcR5324却能在整个培养过程中产生Lac，且分别在培养前期与后期各有1个产酶高峰[18]，这可能是受不同调控因素调控产生不同Lac同工酶造成的。为验证这种可能性，比较了突变菌株不同时间产生的Lac同工酶的差异。结果显示，不同培养时间的酶液经电泳分离与Lac特异性染色后，出现了1～3条不等的同工酶条带(图1)，酶带颜色深浅及宽度反映了Lac含量与活性的高低。菌株pcR5305培养1～3 d产生1条颜色较浅的酶带，而培养4～7 d则产生多达3条同工酶条带，其中1条颜色较深，另2条颜色逐渐变深，8～15 d产生2种同工酶，其中12～14 d产生的同工酶条带颜色较深且酶带较宽(图1a)。另一菌株pcR5324培养12～15 d产生颜色较深的2条酶带，培养1～11 d只产生1条同工酶酶带，6～8 d产生的酶带颜色较深(图1b)。为进一步比较菌株产生同工酶的差异，对同工酶电泳图谱进行了聚类分析。

图1 不同时间(d)产Lac同工酶谱分析Fig.1 The analysis of the isoenzyme zymogram of the laccase produced by the mutants at different time a：pcR5305;b：pcR5324

2.2 Lac同工酶电泳迁移率及其聚类分析

依据图1电泳结果计算各同工酶的相对迁移率Rf值(表1)，并以Rf为特征绘制酶谱模式图(图2)，用DPS软件以最长距离法进行聚类并构建树状图(图3)。结果显示，不同菌株在不同培养时间产生的同工酶条带虽存在差异，但酶带排列仍具有相似性，如2个菌株在整个培养过程中都存在1条Rf为(0.595±0.02)的酶带，pcR5305在4～7 d和pcR5324在12～15 d均有Rf为(0.52±0.020)的酶带，但pcR5305在4～15 d出现了pcR5324并不具有的Rf为(0.458±0.02)的酶带。

表1 Lac同工酶相对迁移率(Rf)

图2 Lac同工酶酶谱模式图Fig.2 The model map of the isoenzyme zymogram of the laccases from mutants a：pcR5305；b：pcR5324

图3 Lac同工酶酶谱聚类分析(最长距离法)Fig.3 Cluster analysis of the isoenzyme zymogram (furthest neighbor)a：pcR5305同工酶聚类；b： pcR5324同工酶聚类； c：pcR5305 与pcR5324同工酶聚类(F为pcR5305,B为pcR5324)a:pcR5305 isozyme cluster; b:pcR5324 isozyme cluster; c:pcR5305 and pcR5324 isozyme clusters (F is pcR5305, B is pcR5324)

pcR5305 在不同时间产生的同工酶可分为2～3类(图3a)，在0.33≤D≤1.10水平上，同工酶的产生可分为3类，分别与该菌株在1～3 d产生1条同工酶带、4～7 d产生3条酶带和8～15 d产生2条酶带结果相对应(图1)；在更低水平1.10

2.3 突变菌株产Lac动力学及其与Lac同工酶之间的相关性

突变菌株pcR5305、pcR5324分别在第7天和第6天完成对数生长期，在15 d的培养过程中均有2个产酶高峰(图4)，两菌株均呈现出产酶与菌体生长同步的初生代谢产酶特性，都分别在第7天和第6天出现第一个产酶峰值。pcR5305菌体生长差于pcR5324，但产酶量高于pcR5324，可能是pcR5305在此阶段合成3种同工酶Lac1～3，而pcR5324仅有1种同工酶Lac3。pcR5305菌株产生的Lac3同工酶条带颜色深浅及其产酶时间分布与产酶动力学中的产Lac活性相对应，在6～8 d及12～14 d产生的酶谱带颜色较深。在4～7 d产生的3条酶带中，Lac2颜色较Lac1深，说明在菌体初生代谢期间，产生的Lac主要由Lac2和Lac3组成；而在12～14 d时，pcR5305只产生Lac1和Lac3两条酶带，而且Lac1颜色较Lac3深，说明Lac1在次生代谢期酶活峰值出现中起主要作用。同样pcR5324也分别在第6天的初生代谢(128.833 U/L)和第12天的次生代谢阶段(382.489 U/L)出现2个产酶峰值。对应于其同工酶图谱，Lac3的颜色深浅与产酶酶活高低相对应，在12～15 d时pcR5324还产生了Lac2，这不同于pcR5305在初生代谢时期产生的Lac2，可能正是Lac2的产生使pcR5324在次生代谢期的酶活高于初生代谢期的酶活。

图4 菌体生长与产Lac动力学Fig.4 The thalli growth and the laccase-producing kinetics

2.4 突变菌株产Lac与营养基质中C、N浓度的关系

突变菌株pcR5305与pcR5324在富氮条件下启动Lac合成与达到产酶高峰以及与培养基中C、N浓度的对应关系列于表3，发现两个突变菌株启动Lac合成与达到产酶高峰对应的介质中碳源葡萄糖、氮源氨氮浓度阀值远高于野生型，突变菌株产Lac已不需要白腐菌产木质素酶固有的营养饥饿条件。野生型黄孢原毛平革菌合成木质素酶受碳氮营养调控，有文献报导C、N对黄孢原毛平革菌产LiP、MnP的调控路径是分开的[22-23]，虽然从表3中难以发现突变菌株产Lac是由碳调控还是由氮调控的，也难以确定C或N调控是否独立，但培养过程中C/N的降低是启动及合成Lac达到高峰的趋势(图5)，在这个过程中基质氨氮的浓度变化不大。因此，基质中碳源浓度的降低则是Lac合成更为重要的调控因素，事实上Lac合成的启动总是发生在葡萄糖快速消耗而导致C/N快速下降之后，这些现象说明突变菌株产Lac虽然不受营养限制，但可能存在更高水平上的C、N互作调控机制。

表3 葡萄糖、氨氮浓度及C/N与产Lac的关系

图5 营养基质C/N变化动力学Fig.5 The changing kinetic of the C/N in the mediums

同工酶 Lac3的产生贯穿于两个菌株的整个生长周期，其产生不受基质中C/N的影响；而同工酶Lac1和Lac2在菌株pcR5305培养的4～7 d出现，且随培养时间的延长产酶量逐渐增加,说明这两种同工酶启动合成需满足较低的基质C/N，而这又同pcR5305能使C/N快速降低达到产酶条件有关。菌株pcR5324在1～5 d内C/N仍处于较高水平，此时仅产生不受C/N影响的Lac3，但Lac2并没有在6～7 d其 C/N与pcR5305 C/N相近时出现，反而在菌体进入次生代谢期的12～15 d才合成,说明Lac2在pcR5324的合成主要受控于次生代谢的其它调节因素。突变菌株产生的3种Lac同工酶中，同工酶Lac3在两个菌株中应该具有相似的合成调控机制，其合成启动及其酶合成的消长均贯穿于两个菌株的整个培养过程，其同工酶的合成启动与积累几乎不受营养基质中N、C以及C/N的限制，Lac2则在不同的菌株中具有不同的调控与产生机理，而同工酶Lac1可能是菌株pcR5305特有的同工酶，在初生代谢期间合成，在介质中C/N较低(约5.0～7.0)时诱导产生。

3 讨 论

目前，有关黄孢原毛平革菌产Lac同工酶的报导不多，而动态产Lac同工酶的报导还未发现。仅Srinivasan等[9]利用非变性凝胶电泳发现黄孢原毛平革菌能产生两种同工酶；Jhadav等[13]发现黄孢原毛平革菌NCIM 1197菌株含有两种组成型同工酶；Dittmer等[24]在MonoQ洗脱柱中观察到4个酶峰并认为黄孢原毛平革菌能产生4种同工酶，MonoQ柱洗脱出现的峰值是否就表示不同的同工酶，还有待于进一步证实。同工酶数的不同可能是由于不同的方法、菌株或生长条件所致。本研究结果显示，不同的同工酶除存在菌株差异外，还与培养条件和时间有关，pcR5305、pcR5324在富氮条件下，不同培养时间内可分别产生1～3种同工酶(Lac1、Lac2和Lac3)，其中pcR5305在4～7 d时最多可产生3种同工酶，pcR5324在12～15 d最多可产生2种同工酶。在产生的3种同工酶中，两个菌株都能产生Lac3，其产酶过程伴随菌体从初生代谢到停止生长的次生代谢的整个生长周期，Lac2同工酶在pcR5305的初生代谢阶段产生，但菌株pcR5324的Lac2同工酶却在营养基本耗尽的次生代谢阶段产生；Lac1只有pcR5305菌株代谢产生，而且既可在初生代谢期间也可在次生代谢期产生，其产酶规律显然同Lac3有所不同，在培养的前3 d基本不产生Lac1，在第4天才出现Lac1的活性并随培养时间的延长其产酶能力逐渐提高。显然Lac1～Lac3的合成在不同的菌株中具有不同的调控机理，这一点与黄孢原毛平革菌另2种木质素降解酶LiP、MnP同工酶产生受营养调控现象基本一致。白腐菌模式种黄孢原毛平革菌产Lac及其同工酶的营养调控以及分子机理还有待于进一步研究，而良好的实验材料pcR5305和pcR5324则为这些研究提供了基础。

野生型黄孢原毛平革菌木质素酶(LiP、MnP、Lac)是典型的次生代谢产物，喻国策等[25]对P.chrysosporium(BKM-F-1767)的研究显示，在初始氨氮浓度低于0.154 g/L时，可检测到Lac的产生，在第6天出现微弱Lac酶活，并在葡萄糖0.06 g/L，氨氮0.01 g/L时的第9天达到产Lac峰值(8.15 U/L)，Lac峰值出现的时间与葡萄糖完全耗尽或接近耗尽以及氨氮处于最低值相对应。当初始氨氮大于0.308 g/L时，很难检测到Lac的活性。本研究中，突变菌株pcR5305及pcR5324可在初始氨氮浓度达2.2 g/L富氮环境下合成Lac，启动Lac合成及达到产酶峰值对应的葡萄糖、氨氮浓度阀值不仅远高于P.chrysosporium(BKM-F-1767)，而且也是WT启动Lac合成时葡萄糖浓度的6～9倍、氨氮的2.5倍、达到第一个产Lac高峰时葡萄糖浓度的11～13倍以及氨氮的2～2.5倍。显然，突变菌株pcR5305及pcR5324对在白腐菌中普遍存在的产酶营养阻遏已不敏感，虽然其抗营养阻遏产酶的分子机理有待进一步研究，但培养过程中C/N的降低是启动及合成Lac达到高峰的总趋势(图5)，碳浓度的降低应该是Lac合成更为重要的调控因素，诱变菌株pcR5324和pcR5305在培养过程中的碳氮消耗比例相近，酶活高峰均在C/N低至7～8左右出现，pcR5305的Lac2、pcR5324的Lac3对第一个酶峰贡献大，而pcR5305的Lac1、pcR5324的Lac2是出现第二个酶峰的主要原因，进一步弄清不同同工酶合成调控的分子机理及其影响因素，将有助于阐明白腐菌木质素酶合成的营养阻遏机制。