林思思，王舒仪，孙旺，施更生

（温州医科大学附属台州医院 口腔科，浙江 台州 317000）

口腔鳞癌是亚洲人头颈部肿瘤中最常见的肿瘤之一[1]，虽然近几十年来其治疗手段不断增加，包括放化疗的应用，使得口腔鳞癌的治疗不再局限于手术切除，但是由于局部侵袭和早期淋巴结转移的特点，其治疗效果仍不太理想，且5年生存率只有50%左右[2]。因此，口腔鳞癌的发生发展机制及寻求肿瘤中特定的分子标志物以便能早期确诊和早期治疗已成近年来研究的热点。

上皮-间质转化（epithelial to mesenchymal transitions，EMT）与肿瘤细胞的转移侵袭有密切联系，即在某种特定情况下，肿瘤上皮细胞会发生一系列变化，会失去上皮细胞的特性而获得间质细胞移动的能力[3]。肿瘤转移的过程中EMT的发生往往伴随着肿瘤细胞从原发部位沿血管、淋巴管等途径向其他部位继续生长[4]，EMT的过程受多种细胞因子和转录因子调控，如E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和Slug均参与其中[3]。E-cadherin是跨膜转运糖蛋白家族中的一员，与钙依赖性的细胞黏附有关，在胚胎发育和器官形成中起重要作用[5]，Vimentin作为中间丝纤维蛋白家族成员，参与构成细胞骨架，主要由间质来源的细胞表达，其在正常上皮细胞中不表达，因此Vimentin可作为EMT的分子标志物。Slug是Snail锌指家族的转录因子之一，与原肠胚形成和中胚层形成有关，同时还涉及细胞分化、细胞移动和细胞凋亡[6-8]。本研究通过对Tca8113细胞转染Slug过表达质粒，观察Slug过表达对口腔鳞癌细胞转移能力的影响，从而为临床筛选药物提供理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 口腔鳞癌细胞株Tca8113细胞来源于台州医院恩泽公共科研平台，GV141/Slug和GV141质粒购自上海吉凯基因科技有限公司，脂质体转染试剂购自上海碧云天科技有限公司，RMPI1640培养基购自美国Hyclone公司，Trizol裂解液购自日本TAKARA公司，FS SYBR Green Master购自上海Rocge公司，Revert Aid Firat Strand cDNA Synthesia Kit购自美国Femrengtas公司，引物购自上海生工生物技术有限公司，兔抗人Slug单抗和Vimentin单抗购自美国CST公司，兔抗人E-cadherin多克隆抗体购自美国Abcam公司，二抗羊抗兔购自美国Biosharp公司。

1.2 方法

1.2.1 转染口腔鳞癌Tca8113细胞：口腔鳞癌Tca8113接种于6孔板，温箱培养24 h细胞贴壁汇合度达到80%～90%时，用lipofectamine6000转染。将细胞分为3组：空白对照组（Control组）细胞不加质粒载体；转染目的质粒组，即GV141/Slug组；转染空载体组，即GV141组。将3组细胞培养24 h后，荧光显微镜下观察细胞内有无荧光表达。

1.2.2 荧光定量PCR检测：将3组贴壁细胞消化离心后，裂解，提取RNA并反转录为cDNA，将反转录所得的cDNA，采用SYBR Green嵌合荧光定量PCR法，以GADPH为内参检测3组细胞Slug、E-cadherin和Vimentin mRNA的含量，其中20 μL反应体系为：1 μL cDNA、0.25 μL上游引物、0.25 μL下游引物、8.5 μL ddH2O、10 μL SYBR Green Q-PCR Supermix，反应条件为：预变性50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，循环阶段95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环，每个样品均设3个复孔，该反应在实时荧光定量仪ABI7500上进行。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3 Western blot检测：将转染后的3组细胞温箱培养48 h后，收集细胞，提取细胞总蛋白，经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离后转到PVDF膜上，用PBS配制的5%脱脂牛奶室温封闭2 h，将封闭过的PVDF膜稍微沥干后，放入干净的杂交袋，以Slug和Vimentin的一抗比例为1∶1 000，E-cadherin以1∶10 000的比例，4 ℃摇床过夜，隔天PVDF膜用10% PBST漂洗，放入1∶10 000的羊抗兔二抗，室温摇动1～2 h，洗膜，ECL显色，应用ImageJ对Western blot结果的灰度值进行分析。

1.2.4 细胞划痕实验：将转染后的3组细胞培养48～72 h，待细胞长满6孔板，用枪头比着直尺，垂直划痕，用PBS清洗细胞3遍，加入无血清培养基，放入37 ℃ CO2培养箱，按0、6、12、24 h取样拍照。

1.2.5 Transwell实验：取Transwell小室放入24孔板中，基质胶铺板，水化，将细胞悬液中的细胞以1×105的密度按每孔200 μL分别接种于Transwell膜上，并在小室下方每孔加600 μL含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，培养24 h后，取出小室，用棉签擦去小室膜内表面的细胞和基质胶，4%多聚甲醛固定，考马斯蓝染色，每孔设3个复孔，实验重复3次，显微镜下观察穿过基质胶膜底的细胞数，以穿过膜底的细胞数来表示肿瘤细胞的侵袭能力。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染效率的检测 细胞培养24 h后，GV141/Slug和GV141组细胞均可见绿色荧光，表明质粒均已转入细胞内，转染率为50%～60%。见图1。

图1 GV141/Slug组和GV141组细胞转染后观察到的荧光（×40）

2.2 3组细胞中Slug mRNA的表达 GV141组与Control组比Slug mRNA表达量差异无统计学意义（P=0.363）；GV141/Slug组与GV141组比Slug mRNA表达量明显升高，差异有统计学意义（P=0.003）。见图2。

图2 3组细胞中Slug mRNA的相对表达量

2.3 3组细胞中Slug蛋白表达 GV141组与Control组比Slug蛋白相对表达量差异无统计学意义（P=0.492）；GV141/Slug组与GV141组比Slug蛋白相对表达量明显升高，差异有统计学意义（P=0.026）。见图3。

图3 3组细胞中Slug蛋白的相对表达量

2.4 3组细胞中E-cadherin和Vimentin mRNA的表达量 GV141组与Control组比E-cadherin mRNA表达量差异无统计学意义（P=0.631）；GV141/Slug组与GV141组比E-cadherin mRNA表达量降低，差异有统计学意义（P=0.042）。GV141组与Control组比Vimentin mRNA表达量差异无统计学意义（P=0.746）；GV141/Slug组与GV141组比Vimentin mRNA表达量明显升高，差异有统计学意义（P=0.031）。见图4。

图4 E-cadherin和Vimentin mRNA在3组细胞中的相对表达量

2.5 3组细胞中E-cadherin和Vimentin蛋白的相对表达量 GV141组与Control组比E-cadherin蛋白相对表达量差异无统计学意义（P=0.902）；GV141/Slug组与GV141组比E-cadherin蛋白相对表达量明显降低，差异有统计学意义（P=0.013）。GV141组与Control组比Vimentin蛋白相对表达量差异无统计学意义（P=0.882）；GV141/Slug组与GV141组比Vimentin蛋白相对表达量明显升高，差异有统计学意义（P=0.025）。见图5。

2.6 划痕实验结果 GV141组细胞在24 h后的愈合距离与Control组细胞比较差异无统计学意义（P=0.463）；GV141/Slug组细胞在24 h后的愈合距离与GV141组细胞比较明显升高，差异有统计学意义（P=0.001）。见图6。

2.7 Transwell实验结果 GV141组细胞24 h穿过小室的细胞数与Control组比差异无统计学意义（P=0.951），GV141/Slug组细胞24 h穿过小室的细胞数较GV141组增多，差异有统计学意义（P=0.042）。见图7-8。

图5 E-cadherin和Vimentin蛋白在3组细胞中的相对表达量

图6 3组细胞24 h愈合的距离

图7 3组细胞24 h穿过小室的细胞数（×40）

3 讨论

口腔鳞癌预后较差，局部侵袭和淋巴结的远处转移是不利于口腔鳞癌预后的重要因素[9]，因此，抑制肿瘤细胞的局部侵袭和淋巴结的远处转移成为提高口腔鳞癌预后效果的关键，但是目前研究仍未寻找出有效的机制。最近研究表明肿瘤的远处转移与EMT密切相关[10]，在某些因素的调节下，上皮细胞会向间质细胞的方向改变，包括细胞形态、细胞结构、细胞间的黏附能力和细胞迁移能力等[11]。E-cadherin作为上皮细胞的黏附分子，由CDH1基因编码，通过细胞外结构域介导的钙依赖性地与细胞间黏附，它的结构域包括5个钙黏蛋白重复、1个跨膜结构域以及1个胞内结构域[12]。在EMT的过程中，E-cadherin的含量降低时，细胞的转移能力增强，肿瘤细胞的侵移能力增强[13]，因此E-cadherin表达缺失与肿瘤转移和复发密切相关。Vimentin可作为EMT的分子标志物之一，已被证实在多种恶性肿瘤如低分化前列腺癌、乳腺癌等中高表达，并且这种高表达与肿瘤细胞的转移、侵袭能力密切相关。Slug作为锌指家族的转录因子之一，有高度保守的C2H2锌指结构域，是EMT的重要标志物，在具有高度侵袭性的肿瘤中均有发现，与胃癌[14]、胸腺瘤[15]等肿瘤的不良预后密切相关，而Slug在许多恶性肿瘤中的表现与E-cadherin蛋白的表现相反，多呈上调的趋势[15-16]。

图8 3组细胞24 h穿过小室的细胞数

研究发现在多种肿瘤中Slug可抑制E-cadherin基因的表达。SHENG等[17]通过转染cDNA发现在未分化甲状腺癌中Slug可抑制E-cadherin基因的表达，为未分化甲状腺癌的靶向治疗提供了实验依据。HAJRA等[18]通过转染质粒发现在乳腺癌中Slug可通过识别结合E-cadherin启动子中的E-box元件来抑制E-cadherin基因的表达。XIE等[19]发现在前列腺癌中，Slug基因可通过p19Arf来抑制E-cadherin的表达。而目前国内关于EMT、Slug和E-cadherin在口腔鳞癌中的研究仍然较少，郑彩云等[20]从蛋白层面，王舒仪等[21]从基因层面分别研究证明在口腔鳞癌细胞中Slug可调控E-cadherin，参与了EMT的发展，但体外研究仍较少见。

本研究选用口腔鳞癌Tca8113细胞为研究对象，构建带荧光使Slug基因过表达的质粒和空载体质粒，并设置空白对照组，将目的质粒和空载体质粒分别用Lipo6000转入细胞中，通过检测Slug mRNA和蛋白的表达情况来检测转染效率，并检测EMT相关的E-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达量，最后用划痕实验和Transwell实验来检测Slug基因过表达对口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞转移和侵袭能力的影响。研究结果发现转染Slug过表达质粒和空载体质粒的Tca8113细胞均可观察到绿色荧光，其表达率在50%～60%，且转染目的质粒的Tca8113细胞其E-cadherin的mRNA和蛋白表达量较其他2组明显减少，与此同时，该细胞组转移和侵袭能力较其他2组有所增强。这一研究结果和在其他肿瘤中的发现相同，即Slug基因与E-cadherin基因存在负相关，并且本研究发现Slug基因高表达可促使EMT的发生。为更加完善进一步了解，未来还应探求在口腔鳞癌中调控Slug的相关机制及Slug诱导EMT发生的相关通路研究，以便早期抑制Slug基因的表达，阻断EMT发展，开展口腔鳞癌靶向治疗。