张明晓，黄陆平，金深辉，陈思佳，戴勤学

（温州医科大学附属第一医院 麻醉科，浙江 温州 325015）

高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）为晚期炎症反应介质，由单核细胞或巨噬细胞在炎症反应中主动分泌[1-2]。丙泊酚作为一种新型静脉麻醉药，因其起效快、苏醒迅速而完全、不良反应少、持续输注后无蓄积等特点，己广泛应用于临床各科的手术麻醉[3-4]。近年来报道丙泊酚具有脑保护作用，而炎症是脑损伤中的关键因素[5-6]。越来越多的研究已证实丙泊酚的炎症调控作用[5，7-8]，但其对HMGB1的调控作用尚未完全阐明。p38 MAPK信号通路是细胞内应激反应信号，其表达广泛，与炎症反应密切相关[9-10]。已有研究证实，丙泊酚能通过抑制HMGB1的表达调控LPS诱导的炎症反应，缓解大鼠急性肺损伤[1]。p38信号通路也可调控TNF-α诱导的HMGB1表达[11]。我们推测丙泊酚能通过p38 MAPK信号通路抑制TNF-α诱导的HMGB1表达，本研究应用TNF-α诱导小胶质细胞炎症反应模型，验证丙泊酚对HMGB1的调控作用及机制。

1 材料和方法

1.1 材料 小胶质BV-2细胞（中国科学院基础医学细胞中心）。丙泊酚、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）购自美国Sigma公司；HRP标记山羊抗兔IgG/鼠IgG、p-p38鼠单克隆抗体、p38鼠多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；抗GAPDH兔单克隆抗体购自德国CST公司；HMGB1鼠单克隆抗体购自英国Abcam公司；RNA提取试剂购自大连Takara公司；反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司。蛋白电泳、转膜与曝光系统购自美国Bio-rad公司；SpectraMax M2型酶标仪购自美国Molecular Devices公司；倒置及正置荧光显微镜购自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 小胶质BV-2细胞培养：将小胶质BV-2细胞接种到DMEM高糖培养基（含100 U/mL链霉素、100 U/mL青霉素和10%胎牛血清）中培养传代2次取生长良好的细胞用于实验研究。

1.2.2 不同浓度丙泊酚及TNF-α处理细胞：不同浓度丙泊酚（5、10、20、50、100、150和200 μmol/L）处理小胶质细胞24 h后，MTT法检测各浓度对小胶质细胞增殖的影响，选择合适浓度的丙泊酚进行后续实验。不同浓度（5、10和20 ng/mL）的TNF-α处理细胞后进行RT-qPCR和Western blot检测HMGB1的mRNA及蛋白表达。

1.2.3 分组：将小胶质BV-2细胞分组，设立对照组、TNF-α（20 ng/mL）组、TNF-α（20 ng/mL）+丙泊酚（10、20、50 μmol/L）组，丙泊酚孵育细胞1 h后再经TNF-α处理6、24 h，收集细胞进行RT-qPCR和Western blot检测HMGB1的表达和p38的磷酸化；将小胶质BV-2细胞分组，设立对照组、TNF-α（20 ng/mL）组、sip38组、TNF-α（20 ng/mL）+sip38组、TNF-α（20 ng/mL）+丙泊酚（50 μmol/L）组、TNF-α（20 ng/mL）+sip38+丙泊酚（50 μmol/L）组，小胶质BV-2细胞经p38的siRNA（10 nmol/L）处理12 h后再经丙泊酚孵育1 h，最后用TNF-α处理细胞6、24 h，收集细胞进行RT-qPCR和Western blot检测HMGB1的表达。

1.2.4 RNA的提取与RT-qPCR检测：细胞研磨后，加入1 mL提取试剂，收集到1.5 mL EP管，加入200 mL氯仿，涡旋15 s，室温静置5 min，12 000×g离心，15 min，4 ℃，吸出无色上层液到另一EP管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10 min，12 000×g离心10 min，4 ℃，去上清，加入1 mL 75%乙醇，7 500×g离心，5 min，4 ℃。去上清，吸出液体，室温干燥10 min，加入DEPC水溶解RNA，测量RNA的纯度（OD260/OD280）及浓度。反转录试剂盒用随机六聚体引物和转录酶将mRNA反转录成cDNA。获得的cDNA通过RT-qPCR分析检测HMGB1 mRNA的表达水平，引物序列见表1。

表1 RT-qPCR的引物序列（5’-3’）

1.2.5 Western blot检测细胞HMGB1、p38和p-p38的表达：细胞裂解后，测蛋白浓度并配平每个蛋白的上样量。等量蛋白通过SDS胶进行分级分离，然后湿法转移至PVDF膜上，相对分子质量小的用0.2 μm孔径的膜，相对分子质量大的用0.45 μm孔径的膜。90 min后用5%脱脂牛奶进行封闭，待封闭好后加入一抗（HMGB1鼠单克隆抗体、p-p38鼠单克隆抗体、p38鼠多克隆抗体和抗GAPDH兔单克隆抗体，均稀释为1∶1 000），置室温摇床孵育2 h之后移至4 ℃摇床过夜。次日加入HRP结合的二抗（1∶3 000），二抗孵育1 h后用TBST洗涤3次。加ECL液避光孵育2 min，曝光仪成像。

1.2.6 siRNA诱导的基因沉默：利用特异性siRNA序列实现细胞内的基因沉默，小鼠p38特异性siRNA购买自上海吉玛制药技术有限公司。采用LipofectAMINETM2000（美国Invitrogen公司）将10 nmol/L的siRNA转染至小胶质BV-2细胞，具体操作根据说明书指示进行。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，2组间比较采用student’s t检验，多组间比较采用单因素方差分析并以Bonferroni校正作后比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 低剂量丙泊酚不影响小胶质细胞增殖 150和200 μmol/L丙泊酚可明显抑制小胶质细胞增殖（P＜0.01），见图1。表明高浓度丙泊酚对小胶质细胞有着细胞毒性作用，可能会影响后续研究，所以后续实验只使用10、20和50 μmol/L浓度的丙泊酚。

图1 MTT法检测不同浓度丙泊酚对小胶质BV-2细胞增殖作用的影响

2.2 TNF-α剂量依赖性地上调小胶质细胞HMGB1表达 与对照组比，不同浓度（5、10和20 ng/mL）的TNF-α组HMGB1 mRNA表达均明显增高（P＜0.05），10和20 ng/mL的TNF-α组HMGB1蛋白表达明显升高（P＜0.05），且TNF-α浓度越高，HMGB1表达越高，见图2。表明TNF-α可上调小胶质细胞HMGB1的表达，后续实验采用20 ng/mL浓度的TNF-α。

2.3 丙泊酚降低TNF-α诱导的小胶质细胞HMGB1的表达 经TNF-α处理后HMGB1蛋白和mRNA表达明显增高（P＜0.01），而与TNF-α组比，10、20和50 μmol/L丙泊酚预处理显著降低HMGB1蛋白和mRNA表达（P＜0.05），并呈现剂量越高，抑制效果越明显的趋势，见图3。

图2 不同浓度TNF-α对小胶质BV-2细胞HMGB1蛋白（A）和mRNA（B）表达的影响

2.4 丙泊酚通过抑制p38激活降低TNF-α诱导小胶质细胞HMGB1的表达 后续对丙泊酚调控TNF-α诱导小胶质细胞HMGB1表达的机制研究发现，与对照组比，TNF-α组p38的磷酸化水平明显增高（P＜0.01），而丙泊酚处理后，p38的磷酸化显著降低（P＜0.01），并呈剂量依赖性（见图4A）。利用siRNA沉默p38的表达后，再用丙泊酚处理，结果发现沉默p38可抑制TNF-α诱导的HMGB1蛋白和mRNA表达升高（P＜0.01），而丙泊酚（50 μmol/L）处理后，sip38+丙泊酚组与si p38组HMGB1蛋白和mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05），见图4B-C；表明丙泊酚可能通过抑制p38激活降低TNF-α诱导小胶质细胞HMGB1的表达。

3 讨论

中枢神经系统疾病或损伤后，小胶质细胞介导的慢性神经炎症反应会损伤局部脑组织，加重病情，不利于神经功能的恢复[12-13]。丙泊酚被报道在缺血性脑损伤中有着保护作用[6，14]，但其对脑损伤的免疫系统调节功能鲜有报道。

丙泊酚作为麻醉药，如果用量过大对细胞也必然会产生影响[15-16]。在研究丙泊酚对小胶质细胞HMGB1调节作用的过程中，当浓度增加到150 μmol/L时，丙泊酚便显示出明显的细胞毒性作用。因此，后续实验选取了较低浓度（5～100 μmol/L）的丙泊酚做进一步的研究。

图3 丙泊酚对TNF-α诱导小胶质BV-2细胞HMGB1蛋白（A）和mRNA（B）表达的影响（TNF-α浓度为20 ng/mL）

HMGB1作为一种细胞因子[17]，其作用是双方面的。一方面它可以引起骨髓细胞的转移，促进表皮细胞的再生；另一方面也会参与自身炎症反应和败血症等[18]。HMGB1与TNF-α、IL-1等早期速发型炎性因子不同，TNF-α和IL-1等作为一种促炎性因子在早期炎症中发挥重要作用，而HMGB1作为介导LPS所致细胞死亡的细胞因子，其产生较晚，且持续时间长，因此被认为是一种重要的晚期炎症反应介质，可在炎症反应中被单核细胞或巨噬细胞表达与分泌，与此同时早期速发型炎性因子与HMGB-1的表达及分泌密切相关[11]。HMGB1在炎症物质如LPS等刺激下由固有免疫细胞分泌，这些介质又能够加强HMGB1的分泌效应，形成一个复杂的细胞因子分泌调节网络。HMGB1是决定特定细胞坏死或凋亡的关键信号，细胞释放出HMGB1引起晚期炎症反应即可诱导细胞死亡，而凋亡细胞即使经受第二次坏死或部分自溶也不会释放HMGB1而诱发死亡[18]。在脓毒症中，在LPS诱导晚期炎症反应中，HMGB1可分泌出胞，加剧炎症级联瀑布反应，导致细胞死亡，由此可见HMGB1在炎症反应中的重要性与致死性毒性[17]。本研究主要探究HMGB1在脑损伤炎症晚期（TNF-α诱导）中的表达。本研究检测了不同浓度TNF-α对小胶质细胞HMGB1 mRNA水平和蛋白水平的影响。结果表明：与对照组相比，20 ng/mL的TNF-α可明显增强小胶质细胞HMGB1蛋白和mRNA表达。而10、20和50 μmol/L的丙泊酚预处理组与TNF-α组相比较，HMGB1蛋白和mRNA水平明显降低，且呈剂量依赖性。所以，丙泊酚可抑制TNF-α诱导小胶质细胞的HMGB1表达。

图4 丙泊酚通过p38调控HMGB1的表达

有研究报道TNF-α可通过p38的激活诱导HMGB1的表达[11，19]。本研究结果发现：与对照组比，20 ng/mL TNF-α可明显增强小胶质细胞p38的激活，而丙泊酚处理可明显抑制p38激活，且呈现剂量依赖性。另sip38转染实验表明：与对照组比，sip38可明显抑制TNF-α诱导小胶质细胞HMGB1的表达，而丙泊酚处理后，并未出现明显差异，说明抑制p38的表达后丙泊酚无法实现对HMGB1的调控作用。

综上所述，小胶质细胞受TNF-α干预后，p38 MARK被激活及HMGB1表达升高，丙泊酚处理后，可显著降低TNF-α诱导的小胶质细胞p38的激活及HMGB1 mRNA和蛋白的表达。而利用转基因技术进一步实验发现丙泊酚对HMGB1的调控作用是通过p38实现[20]。由此可见，丙泊酚在脑损伤免疫炎症系统中的调控作用可能是通过其对p38/HMGB1的调控作用实现的。