路晓青,江 念,黄志宝,冯 翔,张新欣,王文凯,*

(1.长江大学农学院,湖北荆州 434000;2.沙洋县长湖湿地自然保护区管理局,湖北荆门 448200;3.湖北民族学院,湖北恩施 445000)

当今社会中人们的生活质量得到很大的提升,生活节奏开始加快,来自各方面的压力也慢慢增大,长此以往,人们便处于焦虑与疲劳状态。感到焦虑与疲劳虽然对人体的伤害不是立即显现,但是这种亚健康状态却是不容忽视的。植物精油作为天然香料从古至今一直在沿用,其安全性和实用性可以得到保证[1-3]。目前关于精油药理作用的文献报道越来越多,现有的研究表明，精油有潜力作为抗氧化剂、镇痛剂、抑菌药物、抗疲劳药物应用于临床医学[4-6]。我国植物资源丰富,其中许多植物精油具有愉悦身心、缓解疲劳、调节情绪、提高免疫力等功能,这类植物精油可作为良好的天然香料进行开发利用[7]。

竹叶椒果为芸香科花椒属植物,该植物始载于《本草图经》,主要分布于我国西南各省。竹叶椒为湖北省特色植物之一,作为药用植物和熏香材料由来已久,民间多用来行气消肿、祛风散瘀、活血止痛、祛蛔、治胃痛[8-10]。现代研究表明，竹叶椒的根、茎、叶、果实均可入药,主要含精油、香豆素、木脂素和微量元素等成分,具有抗菌、抗炎、增强免疫等作用[11-12]。因此,分析竹叶椒果实精油的化学成分并对其进行功能性评价具有重要意义。

目前对竹叶椒果虽有研究,但是对其产生功能性的成分、特性等研究较少。本文通过提取竹叶椒果实精油,利用GC-MS分析其精油的成分,并采用熏蒸的方法进行小鼠抗疲劳、抗氧化、安眠镇静的药理实验,进一步评价竹叶椒果实精油的药理功能,为开发竹叶椒果实精油保健产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昆明种雄性小鼠(KM小鼠) 6周龄，健康,体重20～25 g,购于三峡大学动物实验中心,合格证号:XSD2016110007;竹叶椒果实 产自湖北省恩施州宣恩县珠山镇解放街);超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)试剂盒 南京建成生物工程研究所。

FA-1004B型电子天平 上海精密仪器有限公司;DFY-500型摇摆式高速万能粉碎机、水蒸气蒸馏装置 天津泰斯特仪器有限公司;TDL-80-2B型低速台式离心机 上海安亭科学仪器厂;TU-1810型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;Agilent6890GC-5973MSD气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司;5V-1A型圣兰德干热挥发器 恩施州红霞化工有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 竹叶椒果实精油的提取 参考[13-15]的方法,取鲜重10 kg的竹叶椒果实,用自来水清洗3次后，用蒸馏水清洗一次,置于通风的阴凉干燥处,自然风干至恒重。采用水蒸气蒸馏法，在料液比1∶30 g/mL，微波辅助2.0 min,蒸馏时间100 min的条件下，提取竹叶椒果实精油,将制得的竹叶椒果实精油经无水硫酸钠除去多余水分,备用。

1.2.2 精油成分分析 GC条件:HP-5MS气相毛细管色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。样品进样口:GC。进样方式:手动。柱箱:平衡时间1 min,升温条件:40 ℃保持5 min,然后3 ℃/min升高到90 ℃,保持5 min,然后8 ℃/min 升高230 ℃，保持5 min。总运行时间:49.167 min[16]。

MS条件:EI离子源;温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;电子能量70 eV;电子倍增器电压1.6 kV;质量扫描范围45～400 m/z[17]。

主要成分选择标准:通过质谱扫描后得出相应的质谱图,质谱谱库检索选择匹配度大于90%的物质。

1.2.3 动物分组与处理 以竹叶椒果实精油为材料,采用干熏蒸法、加强熏蒸法两种熏香方式处理小鼠；采用低、中、高三种处理浓度分别对应处理时间为1、2、3 h(精油浓度分别为1.25、2.5、3.75 mL/m3)。

干热熏蒸法:熏香处理中用体积0.8 m3的纸箱罩住鼠笼,采用圣兰德干热挥发器调整精油挥发速度,每天正常饮食,上午9点～12点对小鼠进行熏香。控制精油挥发剂量为1 mL/h,研究每天熏香处理1、2、3 h对小鼠的影响,每组小鼠20只。空白组20只小鼠,不进行熏蒸处理。

加湿熏蒸法:熏香处理中用体积0.8 m3的纸箱罩住鼠笼,将3 mL精油加5 mL 80%乙醇混合,溶于1 L水中,调水至恒温90 ℃,用雾化器调节雾化速度为0.33 L/h,研究每天熏香处理1、2、3 h对小鼠的影响,每组小鼠20只,空白组20只小鼠,不进行熏蒸处理。

1.2.4 指标测定

1.2.4.1 抗氧化测定 小鼠连续熏香处理30 d后,每组取8只,禁食1 d,断头取血。血样于4 ℃的冰箱中静置后,在离心机中以4000 r/min离心20 min,取上清液,分别按照SOD试剂盒、GSH-Px试剂盒、MDA试剂盒说明书方法，测定血清中SOD活性、和GSH-Px活力与MDA含量[18]。

1.2.4.2 抗疲劳测定 游泳时间:小鼠连续熏香处理30 d后,取6只让其在恒温水槽中进行负重游泳(游泳过程中小鼠尾部绑有体重10%的铅丝),水槽深度50 cm,水温(27±5) ℃。记录从小鼠开始沉入水面下10 s后不能浮出水面的时间,此时间即为游泳力竭时间[19]。

爬杆时间:小鼠连续熏香处理30 d后,取6只进行爬杆试验,实验前训练30 min,将小鼠置于玻璃棒上,玻璃棒直径1 cm,记录小鼠由于肌肉疲劳从玻璃棒上跌下的时间[20]。

1.2.4.3 凝神效果 熏香处理小鼠后每周测一次小鼠睡眠发生率,每天15点为饲料投放时间,在投放饲料2 h内，观察记录各实验组入睡动物数,小鼠翻正反射消失达1 min以上的鼠数为入睡动物数,测小鼠睡眠发生率[21]。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 竹叶椒果实精油中各化学成分GC-MS图谱

采用GC-MS对竹叶椒果实精油进行分析,所得总离子流图见图1,鉴定其成分,通过质谱图面积计算含量。

2.2 竹叶椒果实精油主要成分分析结果

竹叶椒果实精油中共检测出59种化学成分,从中鉴定出25种物质,所检测的成分占精油总量的82.61%。由表1所示,竹叶椒果实精油中主要为醇类物质和烯类物质;醇类物质9种,占精油总量的39.22%;烯类物质12种,占精油总量的36.94%;酯类物质1种,占精油总量的1.33%;酮类物质1种,占精油总量的0.11%;苯类物质1种,占精油总量的1.03%。在鉴定的25种成分中,桉叶油醇(36.19%)、萜品烯(21.31%)和3-蒈烯(8.45%)是构成竹叶椒果实精油的主要成分。

表1 竹叶椒果实精油主要成分分析结果Table 1 Analysis results of main components in essential oil of Zanthoxylum armatum DC.

萜品烯对植物氧化性损伤具有显著的修复作用,且单独作用或和其他物质协同作用均可[23]。甜橙精油中含有大量烯类物质,其中包含α蒎烯、萜品烯、3-蒈烯等,且3-蒈烯所占比例较高[24],甜橙精油具有增强小鼠运动能力、缓解小鼠抑郁症状的作用[25]。

陈玉等[16]研究了竹叶椒树皮中的化学成分,主要有白屈菜红碱、卡瑞花椒碱、4-甲氧基-1-甲基-2-喹诺酮等11种物质,其中主要以生物碱和同类物质为主,和本文所测成分相比可得,同种植物不同部位的化学成分相差巨大。刘建华等[26]对贵州产竹叶椒果实的精油中进行研究,从中分析出32个组分,烯类物质和醇类物质为主要成分,和本文研究结果相似;但是其中β-石竹烯、α-葎草烯、L-芳樟醇、α-蒎烯含量较高,和本文存在差异,对比本文研究可知,同种植物同种部位竹叶椒，由于种植环境不同，其化学成分也不同。

2.3 竹叶椒果实精油熏香对小鼠抗氧化效果的影响

由表2～表3得出,通过30 d的处理后,两种方法对小鼠血清中的SOD活力、GSH-Px活力和MDA含量都有一定的影响,随着剂量的加大,SOD活力和GSH-Px活力呈逐渐升高趋势,MDA含量呈逐渐降低趋势。

表2 干热熏蒸法处理小鼠血清中抗氧化指标Table 2 Antioxidant indexes in serum of mice of dry heat fumigation treatment

表3 加湿熏蒸法处理小鼠血清中抗氧化指标Table 3 Antioxidant indexes in serum of mice of humidification fumigation treatment

由表2可得,干热熏蒸法处理小鼠过程中,和对照相比，低剂量的SOD活力稍有增加,但差异不显著(p>0.05),中剂量和高剂量组和对照相比达到显著性差异(p<0.05);三个剂量组和对照组相比,GSH-Px活力均达到显著性差异(p<0.05);对于小鼠血清中MDA含量，中、高剂量组和对照相比，均达到显著性差异(p<0.05)。

由表3可得,加湿熏蒸法处理小鼠过程中,处理组和对照组相比,三个剂量组的SOD活力均达到显著性差异(p<0.05);处理组和对照组相比,中、高剂量组的GSH-Px活力达到显著性差异(p<0.05);处理组和对照相比,三个剂量组的MDA含量均达到显著性差异(p<0.05)。综上所述,两种处理方式过程中,当0.8 m3的体积中竹叶椒果实精油剂量达到2 h时,对小鼠血清中的SOD和GSH-Px活力有显著增加作用(p<0.05),对MDA含量有显著降低作用(p<0.05),说明对小鼠有较强的抗氧化功效。

干热熏蒸法和加湿熏蒸法两种处理方式之间对比,从整体上看加湿熏蒸法的SOD、GSH-Px活力较强,MDA含量较低,且两种处理方式最高剂量组的三个检测指标均与对照组达到显著性差异(p<0.05)。对比两种处理方式,对小鼠抗氧化性效果来看,加湿熏蒸法要强于干热熏蒸法。

2.4 竹叶椒果实精油熏香对小鼠抗疲劳效果的影响

由表4～表5得出,在处理30 d后,两种熏香方式三种剂量均能增加小鼠负重游泳和爬杆时间,且中、高剂量组达到显著水平(p<0.05);对于小鼠负重游泳时间的提升大于小鼠爬杆时间,在高剂量组的两种处理方式下,小鼠负重游泳时间延长率分别达到74%、99%;两种处理方式对比,加湿熏蒸法对抗疲劳的效果更明显。

表4 竹叶椒果实精油熏香对小鼠游泳时间的影响Table 4 Effect of incense on swimming time of mice

表5 竹叶椒果实精油熏香对小鼠爬杆时间的影响Table 5 Effect of incense on pole climbing time of mice

2.5 竹叶椒果实精油熏香对小鼠凝神效果的影响

由表6得出,在处理1周后,干热熏蒸法处理对小鼠睡眠发生率效果不显著(p>0.05),加湿熏蒸法处理对睡眠发生率有一定的增效作用;在处理2周及2周以后,两种处理方式各剂量均能提高睡眠发生率,除干热熏蒸法低剂量处理组外，均达到显著性差异(p<0.05);处理4周后,加湿熏蒸法高剂量处理组对小鼠睡眠发生率影响最大,睡眠发生增加率为27.5%。

表6 竹叶椒果实精油熏香处理小鼠后睡眠发生率(%)Table 6 The incidence rate of sleeping of mice after treatment of incense(%)

3 结论与讨论

竹叶椒果实精油经GC-MS鉴定出25种成分,其中主要成分有三种,分别为桉叶油醇(36.19%)、和萜品烯(21.31%)和3-蒈烯(8.45%)。抗氧化试验中,竹叶椒果实精油对小鼠血清中SOD、GSH-Px均有提升作用,对MDA含量有降低作用,说明在研究的剂量范围内,竹叶椒果实精油对小鼠有很好的抗氧化效果。抗疲劳试验中,对小鼠负重游泳时间和爬杆时间均有增加作用,说明对小鼠抗疲劳有很好的效果。通过观测小鼠进食后2 h内的睡眠率可以发现,精油熏香处理可以增加小鼠睡眠率,且随着时间和剂量的增加效果更明显。从处理方式来看,在试验剂量相同的情况下，在抗氧化效果、抗疲劳程度、增进睡眠方面，加湿熏蒸法都比干热熏蒸法效果好。在试验范围内，各方面指标显示剂量越高，效果越好，且未发现任何不适现象,竹叶椒作为一种熏香材料具有巨大的发展潜力。