刘文敏， 张晓娜， 魏朋浩， 汝少国

(中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003)

近年来，双酚S(BPS)由于具有优良的耐热、耐光和抗氧化性能[1]，替代了双酚A广泛用于食品包装材料、食品罐内衬、奶瓶和纸制品等的生产中[2]，并已经由各种途径释放到环境中，Yamazaki等[3]发现BPS在中国珠江、印度Buckingham Canal和Adyar River中的含量分别为0.135、1.08和6.84 μg/L；Liao和Kannan[4]在美国奥尔巴尼的多种食物样品中均检测到了BPS，BPS污染水平在逐年加重[5]。已有的研究发现BPS较BPA不易降解、易累积[6]，具有生殖毒性和内分泌毒性[7-9]，且BPS发挥着雌激素效应[7-8]。许多研究表明眼科疾病与雌激素水平变化有关[10-11]，有怀孕史或正怀孕的女性雌激素水平高于未怀孕女性，更容易产生视网膜疾病[12]。已有研究表明，多氯联苯PCB1254[13]、苯并a芘(BaP)[14]和多溴联苯醚DE-71[15]等具有雌激素效应的环境污染物均能够损伤斑马鱼的视网膜结构和功能，导致鱼类的视觉障碍。然而，BPS是否会造成雌性动物视觉毒性目前尚未见报道。

眼睛发育在脊椎动物中比较保守[16]，斑马鱼的视觉系统结构与人类的非常相似[17]，斑马鱼视觉系统比较发达，视觉发育迅速，成鱼具有明显的昼夜节律，对光反应强烈，是研究视觉的重要模式生物[18]。眼动反应(Optokinetic response, OKR)和视动反应(Optomotor response, OMR)是评估视觉功能的简单、有效指标[19]。OKR依赖于成熟的、功能性的视网膜[20]。OMR与视杆细胞中的视紫红质视蛋白(zfrho)及视锥细胞中的红光敏感视蛋白(zfred)和绿光敏感视蛋白(zfgr)有关[21]。因此，本文研究了BPS长期暴露对雌性斑马鱼视觉行为OKR和OMR的影响，观察了眼睛视网膜组织学切片，并对视网膜及其各层：包括外核层(ONL)、内核层(INL)、神经节细胞层(GCL)、外丛状层(OPL)和内丛状层(IPL)的厚度进行了定量统计分析，实时定量PCR方法检测了雌性斑马鱼视蛋白基因(zfrho、zfblue、zfgr、zfred和zfuv)的表达变化，系统研究了BPS长期暴露对雌性斑马鱼视觉行为、视网膜结构和视蛋白基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验物质

BPS (CAS NO:80-09-1, purity≥ 98%, 购自Sigma-Aldrich (Shanghai, China)。助溶剂为二甲基亚砜(DMSO)，BPS储备液浓度为0.01和1 mg/mL，室温避光保存。

1.2 斑马鱼养殖和BPS暴露实验及取样

将成年T系雌雄斑马鱼(zebrafish,Daniorerio)分开饲养于25 L连续曝气24 h以上的自来水中，饲养条件为：水温(27±1) ℃，光暗比为14 L∶10 D，DO=(7.0±0.1) mg/L，pH=(7.8±0.2)，每天喂食2次孵化的卤虫(Artemiasaline)。分开2周后，选择怀卵雌鱼和健康雄鱼按1∶2的比例进行光照刺激产卵，次日收集受精卵，清洗后用于暴露实验。

实验采用半静态毒性试验方法。受精后2 h (hpf, hours post-fertilization)-受精后15 d (dpf, days post-fertilization)，斑马鱼仔鱼饲养于1.5 L BPS暴露溶液的烧杯中；15～40 dpf，斑马鱼幼鱼饲养于4.5 L暴露液的烧杯中；40～120 dpf，斑马鱼饲养于30 L暴露液的鱼缸中；每天更新2/3的暴露液(依次为1、3和20 L)。设置1、10、100和1 000 μg/L BPS暴露组，同时设置空白对照组和溶剂对照组(DMSO, 0.002%)。BPS暴露斑马鱼胚胎(2 hpf)至性成熟(120 dpf)，具体操作和斑马鱼的喂食情况如图1所示。

图1 BPS长期暴露示意图

暴露结束后，称量体长和体重后解剖辨别雌雄，取每条雌性斑马鱼的一只眼睛置于1.5 mL离心管中，每三条鱼的眼睛混为一个样品，取6个平行样品，迅速冷冻于液氮中，随后转移至-80 ℃保存，用于基因表达水平的测定。另取7只眼睛固定于10%中性福尔马林固定液中24 h后用于制作石蜡切片。随机取8条鱼用于视觉行为OKR和OMR的测定。

1.3 斑马鱼行为学实验

斑马鱼视觉已被证明有明显的生物节律性[22]。OKR和OMR实验安排在上午10:00—12：00，15:00—18:00进行。

OKR实验参照Cameron等[23]的方法，光栅条带选择12 cycles，光栅直径为11 cm，光栅转速设置为25 cycles/min，对应时间频率为150°/s，光对比度设置为0.3。麻醉并固定雌性斑马鱼于OKR行为杯子中，调整鱼体使其身体背侧向正上方，加水后放入刺激装置中，调整显微镜使至合适视野、放大倍数并对焦使图像清晰，待鱼清醒5 min后，光强度和光栅刺激各适应1 min后由CCD拍摄记录眼动，通过自制软件分析获得OKR行为学数据。

OMR实验参照Zou等[24]的方法，光栅直径为12 cm，光栅密度为12个周期，刺激频率为25 r/min，CCD视频拍摄帧率为30帧/s。将雌性斑马鱼放进OMR行为杯子中，刺激适应1 min后顺时针(clockwise, CW)开始记录，之后休息1 min，逆时针(Counterclockwise, CCW)方向重复上面操作。采用自制软件统计追随百分比(追随光栅的时间除以总记录时间再乘以100%)。

1.4 雌性斑马鱼眼睛石蜡切片的制备

固定后的雌性斑马鱼眼睛经梯度乙醇脱水后，用二甲苯透明，浸蜡包埋，进行常规切片，厚度为5 μm，苏木精-伊红(H-E)染色。Nikon光学显微镜下观察并拍照，Image J软件测量眼睛视网膜及各层结构：RPE、ONL、INL、IPL、GCL的厚度，每组选取7只鱼眼，每只鱼眼选取视网膜中央部位测5处。

1.5 实时定量PCR (qPCR)

Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)法提取眼睛总RNA，NanoDrop ND-2000c紫外分光光度计测定总RNA的质量及浓度。等量的质量合格(1.9< 260/280< 2.0)的总RNA(1 μg) 利用gDNA Eraser消除基因组污染，然后利用PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa, Shiga, Japan)将RNA反转录为cDNA。

根据Genbank已发表序列设计各基因特异性引物(见表1)。qPCR实验采用Eppendorf MasterCycler ep RealPlex4)定量PCR仪，按照SYBR green mix kit (TaKaRa, Dalian, China)说明书进行。反应体系为20 μL，反应程序为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。各PCR反应最终进行溶解曲线分析，扩增产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，确定扩增片段的特异性。目的基因mRNA的相对丰度采用2-ΔΔCt法[25]，以β-actin和elfa为内参(经内参基因的筛选β-actin和elfa为最优双内参组合)，计算不同暴露组目的基因的相对表达量。

表1 荧光定量引物序列

1.6 统计学分析

柱状图利用Graphpad prism 5.0完成，结果均以平均数±标准差表示，应用SPSS软件对数据进行统计学分析，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Tukey多重比较，P<0.05表示差异显著(用*标记)，P<0.01表示差异极显著(用**标记)。

2 结果

2.1 BPS长期暴露对雌性斑马鱼OKR和OMR的影响

不同浓度的BPS暴露斑马鱼胚胎至性成熟120 d，与溶剂对照组相比，10和100 μg/L暴露组雌性斑马鱼OKR的SPG值(慢速相gain值，慢速相中斑马鱼眼睛转动的角速度与光栅转动角速度的比值)显著下降(见图2)；无论顺时针(CW)还是逆时针(CCW)转动，与溶剂对照组相比，各暴露组雌性斑马鱼的光栅追随率虽有所下降，但均无显著性差异(见图3)。

(n=8；表示P< 0.05。 means P< 0.05.)图2 BPS长期暴露对雌性斑马鱼OKR的影响

(光栅转动方向：顺时针和逆时针。The striped drum was rotated CW and CCW.n=8)

图3 BPS长期暴露对雌性斑马鱼OMR的影响
Fig.3 The optomotor response of female zebrafish exposed to BPS for 120 days

2.2 BPS长期暴露对雌性斑马鱼眼睛视网膜厚度的影响

不同浓度的BPS暴露斑马鱼胚胎至性成熟120 d，溶剂对照组(见图4A)、10 μg/L(见图4C)、100 μg/L(见图4D)和1 000 μg/L BPS暴露组(见图4E)雌性斑马鱼的视网膜组织结构完整，各层细胞排列规则整齐，密度均匀；1 μg/L BPS暴露组视网膜RPE层出现小的空隙(图4B白色箭头)。对视网膜及各层定量结果显示，与溶剂对照组相比，1 000 μg/L BPS暴露组RPE、ONL、IPL、GCL和视网膜厚度分别显著增加了41.9%、28.4%、20.9%、25.5%和24.9% (见图5)。

(A.溶剂对照组；B.1 μg/L；C. 10 μg/L；D. 100 μg/L ；E 1 000 μg/L BPS暴露组，标尺为50 μm。 A. The solvent control with normal layering; B. 1 μg/L; C. 10 μg/L; D. 100 μg/L ; E. 1 000 μg/L BPS-treated groups. Scale bar: 50 μm.)

图4 BPS长期暴露对雌性斑马鱼眼睛视网膜结构的影响

Fig.4 Histopathological analyses of female zebrafish retina structure between the solvent control and BPS-treated groups

(n=7，❋表示P<0.05。❋means P< 0.05.)图5 BPS长期暴露对雌性斑马鱼眼睛视网膜及各层厚度(μm)的影响

2.3 BPS长期暴露对雌性斑马鱼眼睛视蛋白基因转录水平的影响

不同浓度的BPS暴露斑马鱼胚胎至性成熟120 d，与溶剂对照组相比，各暴露组zfred(见图6A)表达量均显著上调，其中1和1 000 μg/L暴露组表达量极显著上调；zfgr(见图6B)和zfblue(见图6C)在1和100 μg/L暴露组的表达量出现显著上调；zfuv(见图6D)在1、10和100 μg/L暴露组的表达量出现极显著上调，而zfrho(见图6E)的表达量在各暴露组均无显著性变化。

3 讨论

本研究结果首次表明，BPS长期暴露能够显著降低雌性斑马鱼的视觉追踪能力。斑马鱼是一种典型的白昼活动和具有较好视觉功能的鱼类，在5 dpf和7 dpf即具有稳健的OKR和OMR，并一直持续到成年[26]。斑马鱼的OKR和OMR都是视觉刺激诱导的视觉行为，无需训练即可诱导产生。Rinner等[27]在研究斑马鱼OKR时用SPG值(慢速相的gain值为慢速相中斑马鱼眼睛转动的角速度与光栅转动角速度的比值)来表征眼睛追踪转动光栅的能力，SPG值降低表明斑马鱼眼睛追踪能力下降，视觉功能受损[28]。本研究中，10和100 μg/L暴露组OKR的SPG值显著下降，表明BPS长期暴露显著降低了雌性斑马鱼眼睛的追踪能力。斑马鱼成鱼主要依靠视觉进行捕食及逃避捕食者等活动[29-30]，雌性斑马鱼视觉追踪能力显著下降说明10和100 μg/L BPS长期暴露可能会影响雌性斑马鱼的摄食行为，进而影响其生长和繁殖。Neuhauss等[31]认为斑马鱼眼睛追踪能力的变化可能与眼睛转动发生机械障碍有关。污染物对生物体正常生理功能的影响存在一个阈值(即安全剂量)，只有当污染物浓度达到这一阈值时才能引发效应[32]，例如，Wang等[13]的研究发现0.125 mg/L多氯联苯(PCB)暴露对斑马鱼视网膜结构和厚度均无显著影响，而0.25 mg/L PCB暴露显著增加斑马鱼眼睛宽度；0.32 μg/L多溴联苯醚(DE-71)暴露对斑马鱼视网膜神经节细胞的数目无明显影响，而浓度达3.58 μg/L时便能显著降低其数目[15]。本研究中1 μg/L暴露组OKR慢速相值无显著变化，可能与BPS浓度较低有关。

OMR实验中，斑马鱼的身体没有被固定，能跟随感知的黑白光栅运动[33]，可通过检测斑马鱼对黑白光栅的趋向性来研究其视觉运动能力[23]，视觉未受损伤的鱼类会追随光栅运动[34-35]，追随百分比越高表示斑马鱼的视觉功能越好，本研究中无论CW还是CCW，雌性斑马鱼的追随百分比均无显著性变化，Neuhauss[36]发现斑马鱼同金鱼[37]一样，其OMR反应依赖于视杆细胞和某种视锥细胞中的视蛋白，斑马鱼含有五种视蛋白，视杆细胞中的视紫红质视蛋白(zfrho)，视锥细胞中的绿光敏感视蛋白(zfgr)、红光敏感视蛋白(zfred)、蓝光敏感视蛋白(zfblue)和紫外敏感视蛋白(zfuv)，它们由光感受器合成，决定视色素的光谱敏感性[38]。Orger 和 Baier[39]的研究表明成年斑马鱼OMR识别视锥细胞中的zfred、zfgr和视杆细胞的zfrho。本研究中BPS长期暴露对雌性斑马鱼追随百分比无显著性影响可能与zfrho的表达量在各暴露组均无显著性变化有关。另外，BPS长期暴露显著上调了雌性斑马鱼中zfred、zfgr、zfblue和zfuv的基因转录水平，Xu等[40]也发现斑马鱼经PBDEs暴露后，其五种视蛋白基因的表达也都出现了显著性上调，推测可能是视色素的另一组成成分生色团视黄醛减少后的代偿性反应，以增强斑马鱼对红光、绿光、蓝光和紫外的敏感性。

(n=3；表示P< 0.05，表示P< 0.01。means P< 0.05, means P<0.01.)

BPS暴露不仅影响斑马鱼的视觉行为，还会对其视网膜结构产生影响。视网膜组织切片结果显示BPS长期暴露并未对雌性斑马鱼的视网膜组织结构分层等造成严重损伤，雌激素通过与雌激素受体(ERs)结合对视网膜发挥保护作用[41-42]。ERs在视网膜中分布广泛，且存在年龄和性别差异，ERα主要分布在年轻女性的视网膜上[41,43]，已有的研究表明BPS具有雌激素效应[7-8, 44]，BPS长期暴露能显著上调雌激素E2的水平[9]，因此，我们推测上调的E2对视网膜的保护作用可能是雌性斑马鱼视网膜分层及细胞排列无明显变化的原因。斑马鱼的视网膜在损伤后具有很强的再生能力，能自我修复多种因损伤导致的视觉功能缺失[45]。因此我们推测1 000 μg/L BPS暴露促进了雌性斑马鱼视网膜细胞再生，导致视网膜及其各层厚度增加，进而使得最高浓度组OKR慢速相值无显著变化。另外，许多眼科疾病如糖尿病视网膜病变[46]、中心性浆液性脉络膜视网膜病变[47]等均与视网膜厚度异常增加有关，高浓度BPS导致的视网膜厚度异常增加虽然对雌性斑马鱼视觉追踪能力没有造成明显影响，但可能会升高上述一些眼科疾病的发病率。

综上，本研究首次从分子、组织学和个体等不同水平探究了BPS长期暴露对雌性斑马鱼的视觉毒性及潜在机制，证实了BPS长期暴露显著降低了雌性斑马鱼的视觉追踪能力，而高浓度BPS增加了视网膜及其各层的厚度，可能会导致视网膜病变的风险升高。环境中BPS可能长期存在且较难降解，因此，BPS长期暴露可能对人的视觉健康造成潜在威胁，需引起研究者广泛关注。