郭霞 ，刘丽红 ，宋治荣 ，李岩 ，杨春霞 ，刘秀梅 ，梁新桃

1.兰州市计划生育服务中心，甘肃兰州 730000；2.甘肃省中医药大学附属医院药剂科，甘肃兰州 730000；3.兰州市食品药品检验所，甘肃兰州 730000；4.兰州佛慈制药有限公司质量部，甘肃兰州 730000

孕子保胎胶囊由菟丝子、陈皮等13味中药组成，自2013年1月—2016年1月门诊的312例患者进行临床研究临床发现，孕子保胎方在治疗不孕症和保胎方面效果显著。该研究依据组方原则、药材的主要活性成分和主要药理作用[1,2-6]研制成方制剂胶囊剂，药材分为菟丝子等9味中药水提；陈皮等4味中药醇提两部分，分别以菟丝子中金丝桃苷含量、陈皮中橙皮苷含量、干膏率为考察指标，优选处方最佳提取工艺。

1 仪器、药材与试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪，Agilent C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm,5 mm）;ELSD-380 检测器；BSA224S型十万分之一电子天平；YZF-6250型台式真空干燥箱；RE-2000A型旋转蒸发仪。

1.2 试剂

金丝桃苷对照品（批号：111521-201708）、橙皮苷对照品（批号：110721-201617）均购自中国食品药品检定研究院，含量测定用；甲醇、乙腈为色谱纯，三重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

1.3 药材

菟丝子、陈皮 、熟地等13味中药均购于甘肃冠兰中药饮片公司，按《中国药典》2015年版一部检验均符合药典标准。

2 提取工艺研究

2.1 水提药材工艺考察

2.1.1 金丝桃苷含量测定 色谱条件：Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 mm）;流动相：乙腈：0.1%磷酸溶液（15∶85）；流速：1.0 mL/min;柱温：25℃,检测波长：360 nm;进样量10 μL;理论塔板数按金丝桃苷计算应不低于3 000[1]。

对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品适量（约10 mg）,精密称定，至250 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液。

供试品溶液的制备及测定：取干膏粉约1.3 g,精密称定，至50 mL容量瓶中，加入80%甲醇40 mL,超声处理(功率500 W,频率 40 kHz)0.5 h,放至室温,定容,摇匀后静止2 min,取上清液用0.22 μm的微孔滤膜过滤,得供试品溶液[2]。

2.1.2 正交实验设计 菟丝子、续断等9味药采用水提取工艺。以水提后的干浸膏得率和金丝桃苷含量为考察指标，考察提取加水量、浸泡时间、提取时间及提取次数4个因素对加水提取效果影响。L9(34)因素水平设计见表1。

表1 水提因素水平

2.1.3 工艺验证 对水提药材菟丝子、续断等9味药按优选工艺进行验证（n=3）,测得平均干膏得率并对含量进行测定。

2.2 醇提药材工艺考察

2.2.1 橙皮苷含量测定 色谱条件：Agilent（4.6 mm×250 mm,5 m）;流动相：甲醇：0.1%醋酸溶液（40∶60）；流速：0.8 mL/min;柱温：25℃,检测波长：283 nm;进样量10 μL;理论塔板数按金丝桃苷计算应不低于2 000。对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量（约1 g）,精密称定，至10 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液。供试品溶液的制备及测定：取干膏粉约0.2 g,精密称定，至25 mL容量瓶中，加入甲醇适量,超声处理(功率 500 W,频率 40 kHz)0.5 h,放至室温,定容,摇匀后过滤,取滤液用0.22 μm的微孔滤膜过滤,得供试品溶液[8]。

2.2.2 正交实验设计陈皮、熟地等4味药采用醇提取工艺。以醇提后的干浸膏得率和橙皮苷含量为考察指标，考察提取的醇浓度、溶剂用量、提取时间及提取次数四个因素对加醇提取效果影响。L9(34)因素水平设计见表2。

表2 醇提因素水平

2.2.3 工艺验证 对醇提药材陈皮、熟地等4味药按优选工艺进行验证（n=3）,测得平均干膏率并对含量进行测定。

3 结果

3.1 水提取工艺正交试验结果

正交试验结果（见表2）显示各因素对提取效率的影响为 A＞D＞C＞B, 其中，A2＞A3＞ A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，D3＞D2＞D1，直观分析可判定为 A2B2C3D3。 方差分析结果（见表3）显示，因素A，D，C对提取结果均显著性影响，差异有统计学意义（P＜0.05）。综合考虑分析，优选出最佳工艺为A2B2C3D3，即加8倍量药材的水,浸泡1.5 h,提取1.5 h,提取 3次。

表3 水提正交试验结果

表4 水提方差分析

3.2 醇提取工艺正交试验结果

正交试验结果（见表5）显示各因素对提取效率的影响为 A＞D＞C＞B, 其中，A2＞A1＞ A3，B2＞B1＞ B3，C2＞C3＞ C1，D3＞D2＞ D1，直观分析可判定为 A2B2C2D3。 方差分析结果（见表6）显示，因素A，C，D对提取结果均显著性影响，差异有统计学意义（P＜0.05）。综合考虑分析，优选出最佳工艺为A2B2C2D3，即用60%乙醇8倍量药材的水,提取1.0 h,提取3次。

4 讨论

目前国家二胎政策全面放开，许多高龄妇女和习惯性流产妇女有强烈的生育意愿，而高龄妇女年龄偏高，卵巢储备功能下降，卵巢产生卵子能力减弱，及伴随卵子质量的下降，进而导致不孕症发生的患者占不孕症妇女的约10%；不明原因的习惯性流产的发病率为1%。传统的西医治疗高龄产妇,主要通过运用性激素药物,促排卵药物等,但可能出现诸多不良反应,且疗效不佳；对于习惯性流产的西医治疗方式：①内科疾病治疗。②医学助孕。③免疫治疗。④子宫病变针对性地治疗。⑤孕期针对病因进行不同的保胎治疗，持续到超过以往流产的月份。⑥子宫颈内口关闭不全，在孕16～22周时，作宫颈内口缝合等方法，对此法治疗效果不甚理想。

表5 醇提正交试验结果

表6 醇提方差分析

该方为自拟方，为解决西医治疗的缺陷和不足，该方在古方寿胎丸[9-11]的基础上进行加减研制而成。对312例患者进行临床研究，对已在外或未在该地用药的112例患者对照观察。其中孕子保胎方药（治疗组）70例，黄体酮治疗组（对照组）42例，引用统一标准，数据均经统计学处理。结果表明：治疗组显效56例（占80.00%），有效组12例（占17.14%），总有效率68例。对照组显效9例（占21.43%），有效20例（占47.62%），占总有效率29例（占69.05%），治疗组疗效明显优于对照组（P＜0.001）。临床发现，整个孕期用药，化验和B超显示，胎儿发育质量良好，故证实孕子保胎方用于预防、治疗习惯性流产及孕后保胎在临床上已取得了极好的疗效。

该研究结合中医理论，张锡纯在《医学衷中参西录》亦言“男女生育,皆赖肾脏作强…… 肾旺自能荫胎也。”《女科要旨》引赵养葵言“胎茎之系于脾，犹钟之系于梁也。”“脾主中气而统血”。脾气健运则血循常道，胎有所养，胎元自固。方以菟丝子、续断、桑寄生养血益精壮腰、安胎为君药；辅以陈皮[15]、白术[16]等调脾益气；佐以柴胡疏肝，白芍柔肝、敛阴养血缓急腹痛；调补脾肾为主、兼以理气养肝安心之药为治疗原则。

该研究将结合中医理论，依据组方原则、药物理化性质及现代药理研究，将药材分为两大部分分别采取水提和醇提两种形式进行提取，综合上述实验结果，同时结合实际生产情况，确定水提最佳工艺条件为：加8倍量药材的水,浸泡 1.5 h,提取1.5 h,提取3次；醇提最佳工艺为：60%乙醇8倍量药材的水,提取1.0 h,提取3次。提取方法可靠，利于大生产需要。

该研究为课题试验的提取工艺部分探讨，在遵循原方，原药材的成分不变，确保临床疗效的情况下，继续研制适宜的服用剂型，克服传统汤药服用不便的缺陷，预将孕子保胎方药研制为胶囊新制剂，投放市场，为广大的不孕症和习惯性流产患者带来福音。