莫胜兰 甘海霞 粟艳琼 梁媛 张步娴 屈素洁 尹彦文 施开创 李军 邹联斌

(广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，南宁 530001)

禽流感是由 A 型流感病毒(AIV)引起的一种禽类病毒性疾病，主要侵害鸡、火鸡、鸭、鹅等，是目前世界上威胁养禽业最重要疫病之一。根据 AIV 血凝素 ( HA) 和神经氨酸酶(NA)的不同，甲型流感病毒可以分为 18 个 HA 亚型和 9 个 NA 亚型[1～4]。1965年，H6 亚型禽流感病毒第一次从火鸡身上分离到，2003 年Wang等[5]试验表明，对水禽无症状的H6亚型禽流感病毒感染鸡后，可引起鸡产蛋率下降和上呼吸道病理变化，甚至导致感染鸡死亡。然而该病毒一直未被引起重视，直到 1997年香港爆发人禽流感之后，Chin等[6]报道从野鸭分离到一株H6亚型禽流感病毒(A/teal/HongKong/W312/97)，该病毒与致人死亡流感病毒 A/HongKong/156/97 (H5N1) 株有7个基因高度同源，从而表明H6亚型禽流感病毒可能是H5N1流感病毒基因提供者，两者重组后的新病毒突破了物种间的屏障，获得了直接感染人的能力。H6亚型禽流感病毒比其他的流感病毒具有更广泛的宿主，能够直接感染哺乳动物，陈妍梅[7]在从事家禽养殖的人血清中检测到H6亚型禽流感抗体。因此，H6亚型AIV在公共卫生意义方面也受到学者的广泛关注。

由于家禽感染H6亚型禽流感病毒后症状较轻，在临床上很难鉴别。为了解决临床诊断的困难，本研究建立了H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法。该方法经实验室和临床上多次验证，证明其特异性强、重复性好、灵敏度高，可用于H6亚型流感病毒的筛查。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与设备 RNA 提取试剂盒、一步法荧光RT-PCR检测剂盒均购自宝生物公司；荧光定量 PCR 仪为美国应用生物系统公司的QuantStudioTM6 Flex。

1.1.2 参考毒株和阳性质粒 H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9 亚型 AIV和鸡新城疫病毒(NDV)的 RNA 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、马立克氏病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)和 H6亚型 AIV HA阳性质粒均由本实验室保存。

1.1.3 引物与TaqMan探针的设计与合成 根据 H6 亚型 AIV HA基因序列保守区域，设计引物和TaqMan探针，上游引物 H6序列：5-′CCTGAGCCTTGAGAATTTTC-A，下游引物H6R序列：5′-GGATAGGAGAATGCCCCA-3′，探针Probe H6序列：FAM-CCATCTATCATTCCAGTCCATCCTCC，扩增片段长度为 192 bp，引物和探针由上海生物工程有限公司合成。

1.1.4 样品来源 本实验室 2013 年～2017年从广西各地采集的 376 份病禽样品和 1967 份家禽拭子。

1.2 方法

1.2.1 待检样品的处理 取病禽肺脏、脾脏和气管各1g加入1 mL灭菌的PBS缓冲液，用组织捣碎机研磨5min后，以8000rpm离心 5 min，取样品上清备用；棉拭子样品直接加入PBS缓冲液1 mL，振荡混匀，取样品上清备用。

1.2.2 待检样品总RNA提取 将1.2.1处理的待检样品上清按照RNA提取试剂盒说明书进行总RNA提取。

1.2.3 荧光定量 RT-PCR 体系建立 在冰浴条件下，在 PCR反应管中按下表用量分别加入各成分：

─ 2× One Step RT-PCR Buffer Ⅲ：10 μL；

─ Ex Taq HS(5 U/μL)：0.4 μL；

─ PrimeScript RT Enzyme MixⅡ：0.4 μL；

─ H6F引物：0.4 μL；

─ H6R引物：0.4 μL；

─ Probe H6探针：0.8 μL；

─ ROX Reference Dye II：0.4 μL；

─ 待检总 RNA 模板：5 μL；

─ DEPC处理水：2.2 μL。

加入试剂后立即离心混匀，置于荧光定量PCR仪中，用如下程序进行反应：第一阶段42 ℃ 反转录 5 min，95 ℃ 变性10 S；第二阶段 95 ℃ 变性5 S，60 ℃ 退火延伸35 S，共 40 个循环；荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。

1.2.4 荧光定量 RT-PCR的敏感性试验 用核酸蛋白分析仪测定H6亚型AIV HA阳性质粒的浓度，将其作系列稀释，使其终浓度分别为1.9 × 107～1.9× 101拷贝/ μL等7个梯度，以此作为模板，分别进行一步法荧光定量 RT-PCR反应；以确定该方法的敏感性。

1.2.5 荧光定量 RT-PCR的特异性试验 对H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9 亚型禽流感病毒和NDV的核酸以及本实验室保存IBDV、IBV、MDV、ILTV等样品提取核酸作为模板，用已建立的H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法进行检测，以验证该方法的特异性。

1.2.6 荧光定量 RT-PCR的重复性试验 将H6亚型禽流感病毒阳性质粒做10倍系列倍比稀释，取其中的1.9×107拷贝/μL、1.9×104拷贝/μL、1.9×10拷贝/μL等3个浓度，用已建立的H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法对3个浓度的质粒标准品进行重复性检测试验，根据最终的Ct值计算组内和组间变异系数，以验证该方法的重复性。

1.2.7 临床样品的检测 对本实验室保存的 376 份病禽样品和 1967 份家禽棉拭子样品分别用本研究建立荧光定量 RT-PCR方法和常规 RT-PCR 方法对样品中的 H6 亚型流感病毒进行检测，以评价该方法临床实用性和两种检测方法的符合率。

2 结果

2.1 荧光定量 RT-PCR的建立

在 20 μL 反应体系中加入 H6F 和 H6R 特异性引物和 Probe H6 探针以及H6 亚型禽流感病病毒 RNA，于荧光定量 PCR 仪上进行一步法荧光定量 RT-PCR 检测。得到了典型 H6 亚型禽流感病毒扩增曲线，结果见图 1。

2.2 荧光定量 RT-PCR的敏感性试验结果

以 10 倍倍比稀释阳性质粒作为模板进行一步法荧光定量 RT-PCR。结果，扩增曲线与 Ct 值之间具有良好的线性关系，相关系数可达 0.999 以上；该方法对 H6 亚型 AIV 阳性质粒的检出下限为 19 拷贝/μL，结果见图 2。

2.3 荧光定量 RT-PCR的特异性试验结果

H6亚型禽流感病毒的一步法荧光定量 RT-PCR 检测方法的特异性试验结果表明，只有 H6 亚型 AIV 的 RNA 或 H6 亚型 AIV HA阳性质粒的检测结果是阳性，其它对照样品均为阴性，结果见图3。

1.H6 亚型禽流感病毒； 2.阴性对照。图1 H6亚型流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法标准曲线图1-7分别为: 1.9×107拷贝/μL ;1.9×106拷贝/μL; 1.9×105拷贝/μL; 1.9×104拷贝/μL; 1.9×103拷贝/μL; 1.9×102拷贝/μL; 1.9×101拷贝/μL;8.阴性对照图2 H6亚型禽流感病毒荧光定量 RT-PCR检测方法敏感性试验结果1:H6阳性质粒;2:H6;3:H1; 4: H3; 5:H4 6: H5; 7: H7; 8: H9; 9: NDV、10:IBV; 11: ILTV; 12:IBDV; 13: MDV;14:阴性对照图3 H6亚型禽流感病毒荧光定量 RT-PCR检测方法特异性试验结果

2.4 荧光定量 RT-PCR的重复性试验结果

将1.0×107拷贝/μL、1.0×104拷贝/μL、10 拷贝/μL浓度的H6亚型 AIV 阳性质粒作为模板用一步法荧光定量 RT-PCR 进行重复性试验，结果表明该方法的组内和组间变异系数均小于 1.5 %，详见下表。

一步法荧光定量RT-PCR的重复性分析

2.5 临床样品的检测结果

利用所建立H6亚型禽流感病毒荧光定量 RT-PCR 检测方法对本实验室保存的 376 份临床病料和 1967 份家禽棉拭子样品进行检测，结果共检测到 H6 亚型禽流感核酸阳性样品 181 份。同时，用普通 RT-PCR 方法对上述样品进行检测，结果 H6 亚型禽流感核酸阳性样品158 份，两种方法符合率为 87.29 %。荧光定量 RT-PCR 的敏感性高于普通 RT-PCR。

3 讨论

H6 亚型 AIV 是低致病性禽流感病毒，感染该病毒的家禽几乎无任何临床症状，但它可能通过候鸟和水禽的隐性感染在禽类之间传播。广西因气候温暖，水网密布，适合水禽饲养，同时也是多种侯鸟迁徙路线的必经之地，因而为H6亚型 AIV提供了适宜的宿主和传播的机会 。从低致病性禽流感病毒的流行病学报道中发现，H6 亚型 AIV 是从水禽禽流感病毒优势毒株[8]。因此，对广西家禽加强 H6 亚型 AIV 的监测具有重要意义。目前对于 H6 亚型 AIV 检测的传统方法有病毒分离与鉴定、血凝抑制试验 (HI)、一步法普通 RT-PCR 和 SYBR GreenⅠ荧光染料法 PCR 等。由于病毒分离与鉴定周期长、操作复杂、容易散毒等；血凝抑制试验 (HI)的特异性不强，容易发生交叉反应；而一步法普通 RT-PCR 需要在 PCR 后进行处理或电泳检测，实验时间也比较长；SYBR GreenⅠ荧光染料 RT-PCR 则因染料本身的特性较易发生假阳性反应；以上这些检测方法的缺点均给H6亚型禽流感的检测带来困扰。而荧光定量RT-PCR检测方法采用了引物和探针的“双保险”，增强了检测的特异性，而且具有快速、灵敏、操作简便等优点，因而更适于临床样品的检测。

本研究建立的H6 亚型禽流感病毒荧光定量 RT-PCR 检测方法用于临床样品检测，与普通RT-PCR相比，敏感性更高，两种方法的检测符合率约为 87.29 %。采用该方法从取到样品到得出检测结果，只需要3小时，大大缩短了检测时间，提高了检测效率，为快速检测 H6 亚型 AIV 提供了较好的技术平台。