李娟娟 梁宁刚 蔡卓 蒋翠文 叶丹妮

(广西大学化学化工学院，南宁 530004)

野花麦属多年生药食同源的草本植物，具有杀菌消炎、清热解毒、利尿消肿等功效[1～3]，对于治疗热痢、肺炎、湿疹等症疗效较好[4，5]。野花麦含有黄酮、蛋白质、多糖等成分，因而作为重要原料已广泛应用于食品和药品行业中。我国许多地区是野花麦分布区域，具有种植的潜力，然而野花麦的种植同样面临重金属污染的威胁。Pb是植物生长的非必需元素，会通过大气、水体及土壤等系统迁移至植物体内毒害其生长，还可通过食物链危害人体健康[6，7]。目前Pb对作物影响的研究已有报道[8]，但对草本中药影响的研究还不多见。本文通过盆栽种植野花麦并进行铅污染处理，测定植株可溶性蛋白、总黄酮及叶绿素的变化情况，从而探讨Pb对野花麦生理性质的影响。

1 实验材料与方法

1.1 试剂及实验材料

牛血清蛋白(BSA)、考马斯亮蓝(G-250) 、芦丁等标液均购于国药试剂有限公司，L-半胱氨酸购于国药集团化学制药有限公司。实验采用分析纯等级试剂，去离子水为实验用水。野花麦于2016年2月购自玉林中药市场。

1.2 野花麦污染处理与采集

将野花麦幼苗(株高约30 cm)种植于盆中，深约5 cm，以水浇淋。待生长稳定，每天浇灌20 mL Pb(NO3)2溶液(浓度分别为250、500、1000、1500、2000 mg/kg)，期间保持光照、湿度等条件一致。记录植株生长的状况。

采集各生长时期(20、40、60d)的样品，于105℃下烘干，冷却后保存于密封袋中。

1.3 样品的消解及Pb的测定

称取烘干野花麦0.1000 g于100 mL烧杯内，加入20mL HNO3-HClO4(5∶1)，浸泡12h，于电热板上加热至白烟冒尽，再加HClO44mL加热至无白烟，冷却后溶液定容至50mL。用原子吸收法测定消解液中的Pb[9]。

1.4 可溶性蛋白含量的测定

将0.1000 g鲜样放进研钵中，加入1.0 mL 0.50 mmol/L L-半胱氨酸、4.0 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液( pH=7.8)、1.0 mL 0.05 mol/L Na2SO4及0.5克石英砂，捣碎成浆，于2000 r/min离心10 min，上清液导入比色管(15mL)；残渣再次加入液体提取，合并所得上清液后定容，即为提取液。移取1.0 mL提取液和2.0 mL考马斯亮蓝(G-250)工作液，放入15mL比色管定容，测其595 nm的吸光度，进而算出可溶性蛋白含量[10，11]。

1.5 总黄酮含量的测定

在0.1000 g鲜样中加入4mL 90%乙醇，超声1h，用等量石油醚在分液漏斗中提取3次，再用旋转蒸发仪于80℃蒸干，以60℃热水溶解所得胶状物并定容于50 mL，即为提取液。取10.0 mL提取液于50 mL容量瓶中，加入1.4 mL 0.72 mol/L NaNO2，1.4 mL 0.27 mol/L Al(NO3)3，静置5 min，加入10.0 mL 1.5 mol/L NaOH，以30%乙醇定容后测定其545 nm的吸光度，并计算总黄酮含量[12，13]。

1.6 叶绿素含量的测定

将0.1000 g鲜样放入研钵中，加5mL丙酮-乙醇-水 (4.5∶4.5∶1) 溶液，研磨，漏斗过滤，提取三次，所有滤液转至50mL量瓶并定容。测定其663、645 nm的吸光度。将A663和A645代入式(1)、(2)、(3)中，得到Ca、Cb和Ct，再按式(4)算出叶绿素含量[14]。

Ca=12.7A663-2.69A645

(1)

Cb=22.9A645-4.68A663

(2)

Ct= Ca+ Cb=20.2A645+8.02A663

(3)

2 结果与分析

2.1 Pb在野花麦体内的累积分布

从表1数据中可以看出，各个部位Pb含量与浇灌液Pb浓度成正比，分布情况为茎部>根部>叶片。污染20 d时，野花麦的生长与未受污染时无差异。当40 d后，1000 mg/kg Pb处理下植株顶部叶片开始出现泛黄萎缩现象，而500 mg/kg Pb处理下植株仍保持翠绿。60 d时，浇淋500 mg/kg Pb溶液的植株有茎部萎缩、叶片枯黄的现象；250 mg/kg Pb处理下植株叶片枯萎但部分茎部仍有绿色。

2.2 Pb对可溶性蛋白含量的影响

随Pb的增加野花麦各部位可溶性蛋白含量都有降低的趋势(图1)。20 d时叶片可溶性蛋白变化不大，但40 d时快速降低，说明叶片此时已受到Pb的明显毒害(图1a)；60 d 时叶片中可溶性蛋白含量迅速降低，此时Pb与可溶性蛋白含量的线性回归方程是y=-37.532x+11.500，r=0.915，P<0.030，为显著负相关。茎部可溶性蛋白在20 d时变化不大(图1b)，40d开始下降，60 d则明显下降。Pb与可溶性蛋白含量在60 d时的回归方程是y=-5.471x+8.196，r= 0.941，P<0.017，呈显著负相关。根部可溶性蛋白随Pb污染的增加而不断下降(图1c)，60 d时两者的回归方程为y= -11.086x+12.165，r= 0.966，P<0.007，表现出显著负相关。这与Pb对可溶性蛋白合成所形成的可能干扰有关。

表1 Pb在野花麦体内的分布(n=3)

图1 Pb对野花麦叶片(a)、颈部(b)、根部(c)可溶性蛋白含量的影响

2.3 Pb对总黄酮含量的影响

叶片总黄酮含量随Pb的增加而下降(图2a)。60 d时叶片Pb与总黄酮含量的回归方程是y= -6.962x+3.079，r= 0.912，P<0.031，为显著负相关。茎部总黄酮随着Pb增加所呈现的变化趋势是先升高后降低 (图2b)，说明茎部初期对Pb污染有一定的耐性，总黄酮升高，但40 d 后开始下降，60d后则迅速下降。Pb与总黄酮含量在60d时的回归方程是y= -4.990x+4.845，r= 0.910，P<0.032，为显著负相关。根部总黄酮随Pb增加而快速下降 (图2c)，60 d 时Pb含量与总黄酮含量的回归方程为y= -4.999x+3.639，r= 0.942，P<0.016，为显著负相关。这说明野花麦体内的Pb对黄酮的合成有明显的抑制作用，Pb含量越高总黄酮含量下降越明显。

图2 Pb对野花麦叶片(a)、颈部(b)、根部(c)总黄酮含量的影响

图3 Pb对野花麦叶片(a)、茎部(b)叶绿素含量的影响

2.4 Pb对叶绿素含量的影响

叶片叶绿素随Pb的增大先是略有升高，然后下降(图3a)，从40d开始叶绿素就明显下降，同时叶片的外观也变为枯黄。茎部叶绿素也是先升高后降低(图3b)，40d后快速下降，60 d后急速降低，同时茎部也开始萎缩。数据分析显示，Pb与叶绿素之间为显著负相关，在60 d 时茎部、叶片叶绿素与Pb的回归方程分别为y= -2.051x+1.731，r= 0.984，P<0.002和y= -14.463x+3.107，r= 0.935，P<0.020。可见，Pb能破坏植株合成叶绿素的机制，使植物的正常生理活动受到影响，Pb含量越高，危害越严重。

3 结论

在Pb污染的土壤上种植野花麦，Pb会进入其植物体内积累，积累量与Pb处理量成正比，积累分布的规律为茎部>根部>叶片。在Pb的毒害作用下，野花麦叶片、茎部和根部的可溶性蛋白、总黄酮及叶绿素等生理生化指标均不同程度地发生变化。在污染初期，低浓度的Pb刺激了野花麦自身的应激机制，造成野花麦茎部的总黄酮以及叶片和茎部的叶绿素等生理指标高于对照组，说明野花麦对Pb的毒害有一定的耐受能力。随着Pb含量的增加，野花麦的各项生理指标均有明显的下降。表明当野花麦体内Pb的毒害作用超过植物的耐受极限时，其自身的新陈代谢活动会受到破坏或抑制，正常生长受到损害，各部位的生理生化指标也受到影响。