陶 茸， 尹国丽， 师尚礼

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

根缘细胞(root border cells)又称根冠脱落细胞(sloughed root cap cells)，指从根冠表面脱落下来并聚集在根部周围的一群特化细胞[1]。它能够合成并向外分泌一系列具有生物活性的化学物质，主要功能在于通过对土壤微生物的特异识别及在根系周围建立一个稳定平衡的根际生态系统，诱导和控制根际微生物的生长，中和有毒物质，从而调节根部环境[2]。根缘细胞具有特殊的生理活性和生物学意义[3]，在调节根尖微生态系统-逆境胁迫中起着十分重要的作用[4-5]。根冠果胶甲基酯酶(pectin methyl esterase，PME)在根缘细胞的产生和发育中有重要的作用[6]，它可以使果胶去甲基化，果胶酸分解；可诱导其它果胶酶基因表达，果胶层降解，最终导致根缘细胞从根冠分离，即根缘细胞游离是根冠PME活性表达的结果，而根缘细胞的游离与根冠PME活性有密切相关性[7]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作为多年生豆科牧草，具有一次种植、多年收获、产草量高、营养丰富、适口性好等突出特点，是优质蛋白质饲料的重要来源，有“牧草之王”之称[8]，紫花苜蓿植株的次生代谢成分主要有黄酮、三萜、生物碱和香豆素，大分子化合物主要为苜蓿蛋白和多糖[9]。有研究表明，种植过紫花苜蓿的土壤，由于自毒作用，连茬种植苜蓿时往往种子发育不良，很难建植成功[10]。造成紫花苜蓿自毒作用的主要次生代谢物质是香豆素、绿原酸、香豆酸、羟基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸等酚酸类物质，其对多数植物种子的萌发和生长具有抑制作用[11]，且在苜蓿植株体内的积累量随着生育时期的延续不断增加[12]。目前，卢成、李志华、荣思川等利用液相色谱法测定了紫花苜蓿植株中自毒物质的含量，发现含量较高的是香豆素和咖啡酸[13-15]。王希、袁莉、柳树权[16-19]等研究了紫花苜蓿不同种植年限、不同品种、不同部位组织的植物浸提液对紫花苜蓿种子萌发、幼苗生长、产草量等方面的自毒作用，发现紫花苜蓿生长过程中产生的皂甙和刀豆氨酸，影响后续苜蓿的生长发育，造成草产量递减；同一苜蓿品种根、茎、叶浸提液的自毒效应，叶浸提液最强，其次为茎浸提液，根浸提液自毒效应最弱，不同苜蓿品种的自毒作用存在差异。蔡登高[20]指出香豆素会影响苜蓿幼苗氮代谢和氨同化的关键酶，导致体内养分缺失。也有学者研究了咖啡酸、香豆素、对羟基苯甲酸等外源酚酸对莴苣(LactucasativaL.)幼苗、人参(PanaxginsengC.A.Meyer)种子萌发、三七(PanaxnotoginsengF.H.Chen)、小麦(TriticumaestivumL.)和大豆(Glycinemax)的化感效应，揭示了咖啡酸、香豆素、对羟基苯甲酸等外源酚酸类物质对这些植物生长发育的影响[21-26]。然而紫花苜蓿主要自毒物质香豆素和咖啡酸对其根缘细胞的化感作用少见报道，本研究采用培养皿培养法研究紫花苜蓿根缘细胞和根冠果胶甲基酯酶(PME)对苜蓿主要自毒物质香豆素、咖啡酸和混合物及其浓度的响应，以期为深入探讨香豆素和咖啡酸对紫花苜蓿生长和发育影响的机理提供依据，同时也为有效缓解和解决苜蓿自毒障碍提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

苜蓿品种：‘甘农9号’紫花苜蓿(MedicagosativaL. ‘Gannong No.9’)，由甘肃农业大学草业学院草业生态系统教育部重点实验室提供，发芽率为95%；

药剂:香豆素(C)；咖啡酸(CF)均为分析纯品，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。混合物(M)由香豆素、咖啡酸按 1:1比例配制。

对照：以蒸馏水处理为对照(CK)

1.2 试验方法

1.2.1外源添加物的配制 称取香豆素、咖啡酸各1 g及混合物(香豆素1 g+咖啡酸1 g)分别溶于4 mL无水乙醇中，定容至1 L，配制成1 000 mg·L-1母液，放入4℃冰箱备用(分别以C，CF和M表示)。处理时将母液浓度稀释至500 mg·L-1，50 mg·L-1，5 mg·L-1，0.5 mg·L-1详见表1。

表1 香豆素和咖啡酸处理配比Table 1 The treatment of coumarin and caffeic acid

1.2.2苜蓿种子萌发及根缘细胞培养 挑选颗粒饱满、无病斑、霉点和虫害的苜蓿种子，经75%酒精消毒3 min，用蒸馏水冲洗种子3～5次，将消毒种子播种于垫有2层滤纸和含多层无菌湿纱布的9 cm直径培养皿中，于恒温培养箱中黑暗培养至种子萌动露白。萌动种子播种于底部铺有两层无菌湿纱布及一层滤纸的9 cm直径培养皿，每皿播30粒，种子上面再盖一层滤纸，然后滴加相应浓度处理液，溶液量以上层滤纸湿润，倾斜时皿底无溶液聚集为宜，蒸馏水处理为对照(CK)，每个处理3次重复，种子置于光周期25℃，12 h，暗周期20℃，12 h的人工气候箱中培养[27]。

1.3 测定方法与指标计算

1.3.1根伸长量的测定 随机选取刚萌动的种子5粒/皿，测其根长，即初始根长，再随机选取经不同浓度酚酸水溶液处理并连续培养12 h的植株5株/皿，测其根长，该根长与初始根长两者之差即为根的伸长量[28]。根相对伸长率=处理组根伸长量/对照组根相对伸长量×100%。

1.3.2根缘细胞的形状观察和数目统计 从蒸馏水培养的苜蓿中，分别剪取根尖长 2.5，5，10，15，20 mm各3条，将剪下的根尖置于滴有蒸馏水的载玻片上，轻轻晃动载玻片，持续 40～50 s，以便充分洗脱边缘细胞。镜检：观察边缘细胞的形状并分别统计边缘细胞的数目，每个根尖检查5个视野。

1.3.3根缘细胞存活率测定 选取根长长度10 mm(根缘细胞数目最多)的植株10个，每个剪取2～3 mm根尖，分别置于洁净的载玻片上，滴加20 μL中性红溶液，静置2 min让细胞充分染色，然后擦去周围染液、加入1滴蒸馏水，轻轻晃动，持续40～50 s，以便根缘细胞充分洗脱下来，镜检(每个根尖检查5个视野)。原生质体被染为红色的为活细胞，不着色的为死细胞，对两种细胞分别进行计数。根缘细胞存活率(survive ratio，SR) =活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%[28]。

1.3.4紫花苜蓿根冠PME酶(果胶甲基酯酶)活性测定 各处理分别取30株根的2～3 mm根尖，置于含有200 μL PME提取液(柠檬酸0.1 moL·L-1，Na2HPO40.2 moL·L-1，NaCL 1 moL·L-1，pH5.8)的研钵中，冰浴条件下充分研磨，将研磨液装入离心管充分震荡后，在冰浴中放置1 h，每隔20 min振荡1次。于4℃，15 000 r·min-1，离心10 min，收集上清液，即为PME酶提取液，-20℃下保存待用。

PME活性检测方法参照Richard等[29]的方法。取10 μL PME酶提取液加入到4 mL底物溶液[果胶0.5%(W/V)，NaCl 0.2 moL·L-1，甲基红0.15%(W/V)，pH 6.8]中，充分混匀，37℃温水浴2 h，用紫外分光光度计于525 nm处测吸光度值(A)，根据标准曲线即可测出不同酚酸处理条件下紫花苜蓿根冠PME酶的活性，重复3次，在PME酶的作用下，果胶去甲基化后，释放出H+使溶液pH值下降，甲基红由黄色变成红色。这种颜色变化可以通过分光光度计检测出来。

标准曲线的制作：分别取12，14，16，18，20，22 μL的0.01 moL·L-1盐酸加入4 mL底物溶液，525 nm下测A值，重复2次。以盐酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，测绘出关于H+值和A值的标准曲线，获得回归方程，然后利用回归方程计算不同PME样品的酶活性。PME酶活性用Root H+μmoL/(cap·h)表示。

1.3.5化感作用敏感指数 化感作用敏感指数(allelopathic response index，RI)采用Williamson[30]公式：

RI=(T-C)/T(T≥C)或RI=(T-C)/C(T

式中，RI为化感效应指数，T为处理值，C为对照值。RI绝对值的大小表示化感作用强度，当RI≥0时，为促进作用；当RI≤0时，为抑制作用。

采用化感综合效应(synthetical allelopathic effects，SE)表示化感或自毒作用的综合效应，SE是供体对同一受体多个测试项目的化感效应敏感指数RI的算术平均值[31]。

1.4 数据分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据统计分析，采用Duncan法进行显著性比较。使用Excel 2010应用软件处理测定数据，并制作图表。

2 结果与分析

2.1 外源香豆素和咖啡酸对苜蓿根长的影响

不同种类不同浓度的外源添加物对苜蓿根长的影响表现出低浓度促进、高浓度抑制的效应，且差异显著(P<0.05)(图1)。0.5 mg·L-1浓度下，三种处理外源添加物对苜蓿根长伸长量均呈现出促进效应，且与对照差异显著，其中M处理的促进效应最强，CF处理次之，C处理最弱，但三者之间差异不显著；50～500 mg·L-1浓度下，三种处理的外源添加物对苜蓿根长伸长均呈现出显著抑制效应，其中C处理的抑制效应最强，M处理次之，CF处理最弱。同种外源添加物不同浓度处理下，0.5 mg·L-1香豆素、咖啡酸及其混合物处理时苜蓿根长伸长量均最大，较对照分别提高了30.23%，45.45%和52.95%，差异显著(P<0.05)；5 mg·L-1咖啡酸和混合物处理显著高于对照，较对照分别提高了45.45%和30.23%(P<0.05)。高于50 mg·L-1浓度处理下，随着添加物浓度的增加苜蓿根尖的伸长量显著降低，500 mg·L-1时，苜蓿根长伸长量均最短，香豆素、咖啡酸及其混合物处理分别较对照降低了59.09%，44.32%和57.5%，显著低于对照(P<0.05)。不同外源添加物处理下，咖啡酸和混合物在低于5 mg·L-1时，随着外源添加物浓度的降低对苜蓿根长生长的促进效应增强，而高于50 mg·L-1时，随着添加物浓度的升高对苜蓿根生长的抑制效应增强；香豆素只有在0.5 mg·L-1浓度处理下对苜蓿根长呈现显著的促进作用，其余处理均呈现显著的抑制作用。即咖啡酸和混合酚酸均以5 mg·L-1为正效应和负效应的拐点，香豆素以0.5 mg·L-1为正效应和负效应的拐点，随着外源自毒物质浓度的升高对苜蓿根伸长的促进效应逐渐减弱，抑制效应逐渐增强。综上，三种处理的外源自毒物质对苜蓿根长伸长的抑制效应最强的是香豆素，其次是混合物，咖啡酸最弱。

图1 香豆素和咖啡酸对苜蓿根长的影响Fig.1 The effect of coumarin and caffeic acid on the root length of alfalfa注：图s，同种酚酸不同浓度对苜蓿根长的影响；图b，不同酚酸同种浓度对苜蓿根长的影响Note:Fig.a：The effect of different concentrations on the root length of alfalfa under the same phenolic acid;Fig.b：The effect of different phenolic acids on the root length of alfalfa under the same concentration treatment

2.2 苜蓿根缘细胞的形状、数目及外源香豆素和咖啡酸对苜蓿根缘细胞活性的影响

有关植物根缘细胞产生的时间有两种模式，一种是根缘细胞几乎与根尖同时出现，另一种是当初生根生长到一定长度时才有根缘细胞产生[32-33]。经镜下观察苜蓿根缘细胞的产生模式，苜蓿根缘细胞与根尖出现的时间属于第二种类型，当根尖生长至2.5 mm时，仅有5～6个根缘细胞出现，根尖伸长至10 mm时，根缘细胞的数量达最大值，约137个。根缘细胞在开始形成时呈圆球形和长椭圆形，之后部分细胞逐渐发育成棍棒状和蠕虫形。经香豆素、咖啡酸及混合物处理的苜蓿根缘细胞存活率与对照相比出现了不同程度的下降，且随着处理液浓度的增加，根缘细胞的存活率显著降低(图3)，表明较高浓度香豆素、咖啡酸及其混合物对苜蓿根缘细胞的活性具有明显的化感抑制效应，同时这种抑制效应因外源添加物种类不同而呈现一定的差异，5 mg·L-1及以上浓度，香豆素处理对苜蓿根缘细胞活性呈现出显著的抑制效应；50 mg·L-1及以上浓度，咖啡酸和混合物处理呈现显著抑制效应(P<0.05)，其余处理均与对照差异不显著。可见，较高浓度下三种处理的外源自毒物质对苜蓿根缘细胞活性的抑制效应最强的是C处理，M处理次之，最弱的是CF处理，即较高浓度香豆素处理对苜蓿根缘细胞活性的抑制作用最显著，当其浓度增至500 mg·L-1时，苜蓿根缘细胞的存活率仅为14.22%，显著低于对照、咖啡酸及混合物处理(P<0.05)。

图2 苜蓿根缘细胞Fig.2 Root border cells of alfalfaa. 根缘细胞形状；b.对照组根缘细胞；c. 处理组根缘细胞(活细胞原生质体显红色，死亡细胞无色或色泽较淡)a. Shape of root border cells;b. Root border cells of control group;c. Root border cells of the treatmen group(Red protoplast exhibits viable border cells，colourless or lighter in color protoplast exhibits dead ones)

图3 香豆素和咖啡酸对苜蓿根缘细胞存活率的影响Fig.3 The effect of coumarin and caffeic acid on the viability of root border cells in alfalfa注：图A.同种酚酸不同浓度对苜蓿根缘细胞存活率的影响；图B.不同酚酸同种浓度对苜蓿根缘细胞存活率的影响Note:Fig.A，The effect of different concentrations on the viability of root border cells in alfalfa under the same phenolic acid;Fig.B，The effect of different phenolic acids on the viability of root border cells in alfalfa under the same concentration treatment

2.3 外源香豆素和咖啡酸对苜蓿根冠PME活性的影响

与对照相比，C处理和M处理的紫花苜蓿PME活性在5 mg·L-1的浓度处理下显著增强(P<0.05)，随着处理浓度的升高，促进效应逐渐降低，当处理浓度增至500 mg·L-1时，香豆素、咖啡酸和混合物处理的苜蓿PME活性均最低，分别较对照降低了75.68%，22.92%与36.49%，差异显著(P<0.05)(图4)。0.5 mg·L-1处理时，香豆素、咖啡酸和混合物处理的苜蓿根冠PME活性较其对照分别提高了20.27%，9.46%与18.92%，但差异不显著。可见，50 mg·L-1及以下浓度下，香豆素、咖啡酸及其混合物处理对苜蓿根尖PME活性具有不同程度的促进作用，表明苜蓿在受到外源添加物质刺激时，可能通过PME活性的升高产生大量的边缘细胞来抵御其自毒作用，进而达到保护根尖的目的，但当外源刺激高于其耐受范围时，PME活性明显降低，同时这种抑制效应因外源添加物种类不同而呈现一定的差异，如500 mg·L-1浓度处理下，香豆素、咖啡酸和混合物对苜蓿根尖PME活性抑制效应最强的是香豆素，混合物次之，咖啡酸最弱。

2.4 外源香豆素和咖啡酸对苜蓿根尖的化感综合效应

香豆素、咖啡酸和混合物对苜蓿根尖的化感潜势差异明显(表2)，综合比较它们对根长、PME活性和根缘细胞存活率的化感综合效应发现，0.5 mg·L-1及以下浓度处理时，C、CF和M处理的外源自毒物质对紫花苜蓿根生长和根缘细胞影响的化感综合效应值依次为0.39，0.46和0.59，表明三种外源添加物对紫花苜蓿根尖促进作用最强的是M处理，CF处理次之，C处理最弱。50 mg·L-1及以上浓度下，三种外源自毒物质对紫花苜蓿根尖抑制作用最强的是C处理，M处理次之，CF处理最弱。同时三种处理的外源自毒物质对紫花苜蓿根尖的促进和抑制效应因添加物种类和浓度的不同呈现一定的差异，C处理浓度为5～50 mg·L-1时，苜蓿根长伸长量的化感作用敏感指数均显著低于CF和M处理，当其浓度增至500 mg·L-1时，苜蓿根缘细胞活性和根尖PME活性均显著低于CF和M处理(P<0.05)。CF和M处理在同种浓度处理下，差异均不显著(P>0.05)。综合三种处理的外源自毒物质对紫花苜蓿根尖化感作用敏感指数可知，香豆素以0.5 mg·L-1为正效应和负效应的拐点，咖啡酸和混合酚酸均以5 mg·L-1为正效应和负效应的拐点，随着外源自毒物质浓度的升高其化感综合促进效应逐渐减弱，抑制效应逐渐增强，且香豆素处理对紫花苜蓿根尖和根缘细胞发育抑制效最强，混合物次之，咖啡酸最弱。

图4 香豆素和咖啡酸对苜蓿根冠PME活性的影响Fig.4 The effect of coumarin and caffeic acid on the activity of PME in root cap of alfalfa注：图A，同种酚酸不同浓度对苜蓿根缘细胞存活率的影响；图B，不同酚酸同种浓度对苜蓿根缘细胞存活率的影响Note:Fig.A，The effect of different concentrations on the activity of PME in root cap of alfalfa under the same phenolic acid;Fig.B，The effect of different phenolic acids on the activity of PME in root cap of alfalfa under the same concentration treatment

表2 香豆素和咖啡酸对苜蓿根生长和根缘细胞的化感综合效应Table 2 The synthesis effect of coumarin and caffeic acid on the root growth and root border cells of alfalfa

浓度Concentration/mg·L-1添加物种类Additive type化感作用敏感指数The allelopathic response indexRIRLRISRRIPA化感综合效应Synthesis effect0.5C0.39±0.07aA-0.01±0bA0.01±0aA0.39CF0.46±0.02aA0.04±0aA-0.04±0aA0.46M0.49±0.01aA0.03±0abA0.07±0.01aA0.595C-0.24±0.03bB-0.08±0.01bAB0.02±0.11aA-0.30CF0.46±0.06aA0.00±0aA0.01±0.00aA0.48M0.40±0.05aA0.03± 0.01aA-0.01±0.00aA0.4250C-0.39±0.07bB-0.22±0.02aB-0.15±0.00aA-0.76CF0.08±0.01aB-0.09±0.01aB-0.14±0.01aAB-0.15M-0.16±0.04abB-0.17±0.07aB0.04±0.01aA-0.29500C-0.47±0.10aB-0.85±0.08bC-0.90±0.03bB-2.21CF-0.26±0.08aC-0.22±0.02aC-0.23±0.01aB-0.72M-0.45±0.13aB-0.31±0.03aC-0.36±0.02aB-1.12

注：RIRL：根长化感敏感指；RISR：根缘细胞存活率的化感敏感指数；RIPA：根冠PME活性的化感敏感指数。不同大写字母表示同种类不同浓度处理下的差异显著性，小写字母表示同种浓度不同酚酸种类下的差异显著性，P<0.05

Note:RIRL:The index of allelopathy effect of the root length;RISR:The index of allelopathy effect of the viability of root border cells;RIPA:The index of allelopathy effect of root cap PME activity．Different capital letters indicate the significant difference in the same phenolic acids of different concentrations;Different lowercase letters indicate significant difference in the same concentration of different phenolic acids at the 0.05 level

3 讨论

根缘细胞起源于根冠分生组织的有丝分裂，经过一系列的不同发育时期，最后在根冠外围形成细胞层，其产生和发育受到内源和外界环境因素的严格调控[34]。本研究结果表明，香豆素、咖啡酸及其混合物对紫花苜蓿根尖和根边缘细胞的发育具有明显的低浓度促进和高浓度抑制效应。50 mg·L-1及以上浓度处理时，香豆素处理对紫花苜蓿根长伸长和根缘细胞活性的抑制效应最强，混合物处理次之，咖啡酸处理最弱；0.5 mg·L-1及以下浓度处理时，混合物处理对紫花苜蓿根长伸长和根缘细胞活性的促进效应最强，咖啡酸处理次之，香豆素处理最弱。这一结果说明，香豆素和咖啡酸的混合物在一定程度上增强了单体香豆素、咖啡酸在低浓度处理中对紫花苜蓿根尖和根边缘细胞活性的促进效应，同时降低了单体香豆素、咖啡酸在高浓度处理中对紫花苜蓿根尖和根边缘细胞活性的抑制效应。50 mg·L-1及以下浓度的香豆素、咖啡酸及其混合物处理对苜蓿根尖PME活性具有不同程度的促进作用，但随着浓度的增加，PME活性明显降低，说明香豆素和咖啡酸在中低浓度时可能诱导了植物根冠PME基因的表达，使PME活性升高，促进了根缘细胞的形成，通过根缘细胞释放某些生物活性物质，中和化感物质，提高紫花苜蓿对自身自毒物质的抵御能力，保护了根尖分生区细胞免遭伤害。但是当处理浓度超过了紫花苜蓿根尖组织的耐受极限(50 mg·L-1)时，整个机体代谢紊乱，导致PME活性迅速下降，根缘细胞的产生受到抑制，降低了对根尖分生区细胞的保护作用，这与王桂芹[34]的研究结果一致，推测PME的活性与植物抵御化感物质之间存在着一定的相关性。当香豆素和混合物的处理浓度为5 mg·L-1时，紫花苜蓿根尖PME活性较对照分别提高了42.74%和48.39%，差异显著(P<0.05)，游离出的根缘细胞数量也显著高于对照，但其根缘细胞活性与对照相比无显著差异性，这可能是由于香豆素和咖啡酸在一定程度上使紫花苜蓿根缘细胞失活所致。同时香豆素、咖啡酸及其混合物能够促进或抑制苜蓿根的伸长生长，可能是通过干扰苜蓿根尖细胞有丝分裂实现的，植物化感作用的一个重要机制是化感物质通过影响受体植物细胞有丝分裂来促进或抑制其生长发育的[35]。

4 结论

本试验研究结果表明：香豆素、咖啡酸和混合物对紫花苜蓿根尖和根缘细胞发育有明显的低浓度促进高浓度抑制作用，且随着处理浓度增加抑制效应显著增强，0.5 mg·L-1及以下浓度的促进作用最强的是混合物，咖啡酸次之，香豆素最弱，50 mg·L-1及以上浓度抑制作用最强的是香豆素，混合物次之，咖啡酸最弱。香豆素和咖啡酸的混合物在一定程度上增强了单体香豆素、咖啡酸在低浓度处理中对紫花苜蓿根长伸长、根缘细胞活性的促进效应，同时降低了单体香豆素、咖啡酸在高浓度处理中对紫花苜蓿根长伸长、根缘细胞活性的抑制效应。香豆素和咖啡酸在一定程度上使紫花苜蓿根缘细胞失活是导致紫花苜蓿根缘细胞活性降低的因素之一，该现象产生的可能原因及其对紫花苜蓿化感作用机理还有待进一步研究。