王晓艳，王世锋，张建设，陈 治，吴常文，高天翔

（1.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江舟山 316022；2.海南大学热带生物资源可持续利用省部共建国家重点实验室培育基地，海南海口 570228；3.中国海洋大学水产学院渔业生态学实验室，山东青岛 266003）

鮨科包括约62属449个种类[1]，多数种类是重要的经济品种。鲈Lateolabrax japonicus，俗称花鲈，体侧有若干黑色斑点。为鲈形目Perciformes鮨科Serranidae鲈属Lateolabrax，是近岸浅海中下层鱼类，喜栖息于河口咸淡水交界处，肉食性，耐寒性较一般温水鱼强，水温14℃以上时摄食[2]。

染色体是基因的载体。染色体研究可通过研究现有物种在染色体结构上的差异来追溯其染色体进化，进而了解染色体结构改变在物种进化分歧中的作用。鱼类在漫长的进化过程中，形成了繁多的演化分枝，物种进化异常活跃。王世锋[3]认为鱼类外部形态特征在不同环境或生理条件上常会发生显著变化，所以传统的形态学鉴定并不能得到准确的分类。DE-AGUILAR，et al[4]提出鉴于细胞遗传学可以揭示在形态学水平上不能体现的种属间相似性和差异性，可能在进化分析方面起到重要作用。而到目前为止，绝大多数鱼类的染色体研究局限于最基础的层次——核型的研究，仅对鱼类基因组中染色体的数目和形态进行描述。本研究采用采用胸腔活体注射PHA及秋水仙素溶液，取鲈鱼头肾细胞进行低渗处理，空气干燥法制片。并对其进行Giemsa染色分析其核型，硝酸银染色研究其核仁组织区（NORs），Ba（OH）2处理研究其异染色质（C-带），并对鮨科鱼类核型研究情况作了统计和分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲈鱼4尾，性腺未成熟个体3尾，雌性个体1尾，购自浙江省舟山市普陀东方水产养殖开发有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 染色体标本制备[2]

参照王德祥等[5]的方法稍作修改。样品个体按1 mL/100 g鱼体重于尾静脉抽血，胸腔注射植物血凝素（PHA）（20血，胸-6g/g[3]鱼体重），3.5 h后以3以5A-6g/g鱼体重注射秋水仙碱，15 min后剪鳃放血取头肾。在0.85%生理盐水中将头肾剪碎，静置，取上层细胞悬液1 000 r/min离心，收集的头肾细胞重悬于0.075 mol/L的KCl溶液中，37℃低渗30 min。1 000 r/min离心收集细胞后用卡诺氏固定液（甲醇:冰乙酸=3:1，V/V）进行固定，连续固定3次，空气干燥法制片。

1.2.2 核型分析

制备的染色体标本经10%Giemsa染色20 min，蒸馏水冲洗，自然晾干后进行显微观察和拍照。选择分散良好、形态清晰、两条臂适当分开且数目完整的中期分裂相约100个进行拍照。进行染色体计数、测量，并根据LEVAN，et al[6]的分类标准进行染色体配对、分组，其中染色体相对长度=（每一染色体长度/单套染色体组总长度）套染色体，臂比=长臂/短臂。

1.2.3 Ag-NORs（银染核仁组织区）

按照HOWELL，et al[7]的方法略加修改。50%硝酸银与20%明胶显影液（内含1%甲酸，V/V）按2:1（V/V）混匀后加于新制备1～2 d的标本上，加盖盖玻片，60℃温浴至标本呈金褐色时迅速用蒸馏水冲洗以移除盖玻片及残留试剂，晾干后即可用于观察，拍照。

1.2.4 C-带

参照SUMNER[8]的方法略作修改。将老化1～2周的染色体标本，在0.2 mol/L HCl中处理30 min，漂洗晾干，置预热至50℃的1%氢氧化钡溶液中处理10～16 s，蒸馏水漂洗晾干，然后在62℃预热的2×SSC中温浴2 h后漂洗晾干，最后用10%Giemsa染色20 min，双蒸水漂洗，晾干后即可用于观察和拍照。

2 试验结果及分析

2.1 染色体核型分析

对鲈鱼92个分散良好的染色体中期分裂相进行观察计数，观察结果见表1。由表1可见鲈鱼中期分裂相染色体总数为48的有83个，占分裂相总数的86.46%，由此可以判断，鲈鱼的二倍体染色体总数为48。表2中各染色体的相对长度是从10个良好中期分裂相中所得数据的均值，最长染色体为5.25，最短染色体为2.41，长度比为2.18，染色体相对长度顺次减少。第12对染色体具次缢痕，最易辨认，其余各相邻染色体对间长度差异不明显，未发现异型性染色体。通过核型分析（表2可知鲈鱼染色体核型为2n=48=48t，FN=48。鲈鱼染色体的中期分裂相和核型图，如图1所示。

2.2 Ag-NORs

在所观察的近200个中期分裂相中，发现鲈鱼的Ag-NORs具有数目多态性和形态多态性（图2）。其中数目多态性表现为：位于第12对同源染色体次缢痕处的Ag-NORs稳定存在于每个中期分裂相中（图2a）；第1对同源染色体其中1条染色体在部分中期分裂相中被银染；甚至在部分分裂相中，几乎所有染色体均能被不同程度银染，这种现象尚未见报道（图2b）。形态多态性主要表现为第12对染色体Ag-NORs大小及银染强度。而在间期细胞中，出现1个和2个银染位点的间期细胞最多，同时又有众多位点被银染的现象，如图3所示。

表1 鲈鱼染色体数目统计Tab.1 Chromosome numbers of L.japonicus

表2 鲈鱼染色体相对长度及臂比Tab.2 The relative length and ratio of chromosome in L.japonicus

图1 鲈鱼染色体中期分裂相及核型Fig.1 The chromosome metaphase and karyotype of L.japonicus

2.3 C-带

鲈鱼大部分染色体具有微弱的C-带，主要位于染色体着丝点位置。其中第1对染色体靠近着丝点位置具有明显C-带，部分染色体具有不稳定的居间C-带。第12对染色体次缢痕处为C-带阴性（图 4）。

3 讨论

迄今为止，已有35种鮨科鱼类进行过核型研究（表3），大多只进行了简单的核型分析，带型研究尚不多见，见表3。

在所统计的35种鮨科鱼类二倍体染色体数均为48（2n=48），半数以上（19/35）为端部着丝粒染色体，而48条端部着丝粒染色体被认为是鱼类的原始核型[4]。鮨科鱼类的染色体核型结构具有很强的趋同性和保守性，种类繁多的鮨科鱼类的形成可能是在鱼类进化过程中，染色体不断重组和积累所造成的。鮨科鱼类染色体臂数从48到96不等，其中4种鱼类中出现了中部着丝粒染色体，如Centropristis ocyurus、Diplectrum eumelum、E.ftrio和E.merrt，这可能是由臂间倒位引起。18种鱼被报道有次缢痕，而次缢痕位置有所不同，如S.fltviventris、Ptrtcentropristis hepttus、Serrtnus ctbrillt位于第1对染色体上；D.rtditle位于第3对染色体位置；Lateolabrax japonicus位于第12对位置；S.scribt位于第 16对染色体；Tlphestes tfer、E.tdscensionis、E.tlextndrinus、E.twotrt、E.ctninus、E.coioides、E.ftscittomtculosus、E.ftscittus、E.gutzt、E.mtltbtricus位于第24对染色体位置，次缢痕处为核仁组织区位置。Ag-NORs数目大多为1对处于靠近着丝粒位置，但在岩石斑鱼E.tdscensionis中发现2对Ag-NORs，其中1对位于端粒位置。本文研究鲈鱼的二倍体染色体数为48，第12对染色体上具次缢痕，与喻子牛等[32]的研究结果一致，银染位点具有形态多态性和数目多态性，形态多态性表现为第12对染色体核仁组织区大小不同，银染位点存在方式不同，数目多态性表现为中期分裂相中银染位点的绝对数目及间期细胞核中银染位点数目。

图2 鲈鱼的银染中期分裂相Fig.2 The silver-staining metaphase of L.japonicus

图3 鲈鱼的银染间期细胞核Fig.3 The silver-staining interphase nuclei of L.japonicus

图4 鲈鱼C-带中期分裂相Fig.4 The C-banding metaphase of L.japonicus

表3 鮨科鱼类染色体概况Tab.3 Review of the chromosome data in the family Serranidae

Ag-NORs表现为C带阳性（异染色质）这种现象在很多研究中均有报道，如鮨科的E.tlextndrinus、E.gutzt、点带石斑鱼 E.gtltbtricus、黑点副锯鮨 Ptrtcentropristis hepttus、九带鮨 Serrtnus ctbrillt、纹首鮨 S.scribt。但鲈鱼的Ag-NORs为C带阴性，而在第1对染色体靠近着丝粒位置却发现了明显的居间异染色质带，DE-AGUILAR，et al[4]在对5种鮨科鱼类细胞遗传学研究中发现辐状沙鮨D.radiale也具有相似的现象，认为这是由于NORs（核仁组织区）易位到其它染色体上，从而导致居间异染色质与NORs不在同一位置。

在染色体进化方面，MARTÍNEZ，et al[15]对鮨科5种鱼类进行了C带研究，结果发现所研究的5种鱼类异染色质含量有减少的倾向，并认为这与鱼类的进化方向一致，即通过丢失异染色质区域中多余的DNA，朝较小的基因组和更特化的方向进化，同时染色体重组方式也导致了异染色质的重新分布。鲈鱼染色体表现为微弱的异染色质带，且并不是每条染色体均存在异染色质带，说明鲈鱼是该科鱼类中较特化的种类。

在鲈鱼染色体银染研究中还发现了非常有趣的现象，即众多银染位点的出现（某些中期分裂相中几乎每个染色体均表现为不同程度的银染阳性），这种现象在鮨科和石首鱼科的研究中都未发现，而在一种鼻涕虫Milax nigricans的研究中发现了类似现象[38]。本次研究进行了多次重复试验，可以排除试验误差，仍发现有相似现象出现，而且在经过C带处理后也没有对银染位点造成显著的减少，在标本放置两个多月后进行银染，多银染位点现象仍然出现。其出现的原因可能是：（1）具翻译活性的rDNA存在于每条染色体上，但在染色体中期这种活性大多会消失，而仅在某些特定染色体的核仁组织区显示为银染活性。这可以从间期细胞核中众多银染位点的存在得到佐证，但究竟是什么起到调控作用尚待进一步研究；（2）染色体进化过程中频繁的易位所造成。