娄迎霞,张安安,程 雷,孙宝国,王成涛,张 婵,*

(1.北京市饲料监察所,北京 100107; 2.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京工商大学,北京 100048)

焦糖色素(Caramel Color;CNS:08.108-110;INS:150a,b,c,d)俗称“酱色”,是一种在食品工业中使用量最大的天然着色剂[1-4]。氨(铵)法焦糖色素是指在加工过程中没有使用亚硫酸盐而仅采用氨或铵盐作为催化剂制成的一类焦糖色素[5],在食品中使用范围较广,用量较大,为目前国内焦糖生产的主流方式[6]。由于氨(铵)法焦糖色素在制备过程中,铵离子参与美拉德反应会产生一定量的4-甲基咪唑(4-methylimidazole,4-MeI),曾被禁止在食品中添加。后经研究和试验认为氨法焦糖色素中4-MeI的含量不会超过每日摄入量(200 ppm)[7-10],作为色素在食品中添加是安全的。我国于 1988 年在新制定的焦糖色素国家标准(GB 8817-88)中恢复了氨法焦糖色素的使用。

随着人们对食品安全问题越来越关注,近年来焦糖产品中存在4-甲基咪唑的问题使该产业的发展受到限制,因此研究低4-MeI焦糖色素产品成为近年来新的研究热点。目前的研究多关注在低4-甲基咪唑的制备[11-14]及焦糖色素与其相关食品和调味品中4-甲基咪唑含量的测定[15-18]。市售氨法焦糖色素色率多为3.2～5.0×104,红色素指数并无要求[19]。焦糖色素的色率和红色素指数限制了低4-甲基咪唑产品在市场中的广泛应用,因此,在关注低4-甲基咪唑生成的同时,尚需保证焦糖色素的色率和红色素指数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

4-甲基咪唑标准品、4-甲基咪唑-d3标准品 百灵威科技有限公司,色谱纯;乙腈 赛默飞世尔科技(中国)有限公司,色谱纯;氨水 天津光复化学试剂有限公司,色谱纯;葡萄糖、碳酸铵 国药集团化学试剂有限公司,分析纯。

1290高效液相色谱仪、6460三重四级杆串联质谱仪、C18Extend色谱柱(100×4.6 mm,5 μm) 美国Agilent公司;4523高压反应釜 美国Parr设备公司;UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司;Free Zone真空冷冻干燥机 美国Labconco公司;DHG-9145电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;AL204分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.3 正交试验设计优化焦糖色素氨法制备工艺 选择反应温度、反应时间、碳酸铵浓度、葡萄糖浓度进行四因素三水平试验,为减少试验误差,选择L18(37)正交表进行正交试验设计。对各单因素进行分析,以水平值为横坐标,同一水平对应的试验结果的算术平均数为纵坐标绘制趋势图,根据各单因素对氨法焦糖色素各考察指标的趋势图选择最佳生产工艺(见表1)。

表1 氨法焦糖色素生产工艺因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal array design

1.2.4 指标测定

1.2.4.1 感官评定及指标评价 根据GB 1886.64-2015食品安全国家标准食品添加剂焦糖色[21]进行感官评定。

1.2.4.2 色率测定 参照文献[22],利用真空冷冻干燥机去除液态焦糖色素中的水分,称取1.000 g(±0.002 g)焦糖色素冻干粉,经水溶解、稀释制得0.1%浓度样液,10000 r/min离心10 min,取上清液,测得610 nm波长处吸光值,重复三次测定,取其平均值 A1,按式(1)计算色率(EBC):

色率(EBC单位)=A1×20000/0.076

式(1)

其中,EBC单位的意义为:当于610 nm处,光密度为0.076时,设定为20000 EBC单位。

1.2.4.3 红色素指数测定 参照文献[22],对上述色率测定样液,用紫外可见分光光度计分别在610 nm和510 nm波长下,测定吸光度A1、A2,按式(2)计算焦糖色素红色指数:

红色指数=10×lg(A2/A1)

式(2)

式中:A1为610 nm处的吸光值,A2为510 nm处的吸光值。

1.2.4.4 4-甲基咪唑含量的测定[23]准确称取10 mg 4-MeI和4-MeI-d3标准品于100 mL棕色容量瓶中,制得100 μg/mL浓度的标准储备液,密封保存于4 ℃冰箱中。测定时将4-MeI标准储备液,梯度稀释,得到0.05～5.0 μg/mL的4-MeI标准品溶液,绘制标准工作曲线,采用内标法定量。以4-MeI-d3作为内标物,内标浓度为1 μg/mL。

对焦糖产品进行200倍的稀释处理,并加入浓度为1 μg/mL的4-MeI-d3,10000 r/min离心5 min,取上清液过 0.22 μm微孔滤膜,上机检测。

HPLC检测部分的参数设定:高效液相色谱仪:Agilent1290;色谱柱:Agilent C18,Extend 100×4.6 mm,5 μm;流动相:A:乙腈,B:含有0.2%氨水的超纯水。按照如下条件进行梯度洗脱:0 min:35∶65(A∶B);3 min:35∶65;4 min:50∶50;8 min:65∶35;12 min:50∶50;13 min:35∶65;16 min:35∶65。流速:0.2 mL/min;柱温:38 ℃;进样量1 μL。

三重四级杆串联质谱参数设定:QQQ型号:Agilent 6460;离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描模式:正离子模式;扫描质量范围:m/z 20～200 aum;喷雾器压力:15.0 psi;干燥气:氮气;温度:300 ℃;流速:10.0 L/min。

分别对4-MeI标准溶液和处理好的焦糖色素样液进行检测。采用内标法进行定量,标准工作曲线为y=0.743620x+7.654302E-04,R2=0.999。

1.3 数据处理

实验操作重复三次,采用Excel软件进行数据计算和绘图。

2 结果与分析

2.1 感官评价结果

全文制备的焦糖色素均为性状均一的黑褐色液体,无杂质,肉眼观察无明显不溶固形物,将其稀释成10 g/L水溶液具有焦香味,满足实际生产需求,因此感官评定结果不作为主要考察指标。

2.2 单因素的选择

2.2.1 反应温度对焦糖色素的影响 色率和4-MeI含量随着反应温度升高而增加,红色指数则与之相反。焦糖化反应过程中单糖在pH<7.0时,加热进行脱水生成糠醛或其衍生物[24-25],两类物质互相聚合或与胺类反应生成深褐色物质,提高色率,反应温度>80 ℃,美拉德反应褐变速度受温度影响较小[26]。4-MeI是美拉德反应的副产物,随着温度的升高,4-MeI的量也不断增多,因此过高的温度不利于4-MeI的生成控制。由图1可知在125～145 ℃范围内色率数值较高,145 ℃时达到最大值,115 ℃时红色素指数最高,4-MeI含量最低。综合考察反应温度对产品特性的影响,选择 125、135、145 ℃三个水平。

图1 反应温度对氨法焦糖色素品质的影响Fig.1 Effects of reaction temperature on caramel color quality

2.2.2 反应时间对焦糖色素的影响 对制备好的焦糖色素进行指标测定,结果发现反应时间的变化对焦糖品质有着重要的影响。图2结果显示:反应时间的增加使焦糖色率和4-MeI含量有了明显的提升,说明随着反应时间的延长成色物质及4-MeI不断的积累。随着反应时间的延长,焦糖色素的红色素指数有所降低。为了避免4-MeI的过度积累,保证焦糖色素良好的红色色调,综合考虑后,因此选择 60、80、100 min三个时间作为正交试验设计的水平。

图2 反应时间对氨法焦糖色素品质的影响Fig.2 Effects of reaction time on caramel color quality

2.2.3 催化剂浓度对焦糖色素的影响 图3结果显示碳酸铵浓度对4-MeI含量及红色素指数的影响较为明显,对色率影响较弱。碳酸铵浓度>4%时,色率的增加趋势变得平缓,在8%处再次突然升高。受碳酸铵浓度增加的影响红色指数降低。4-MeI含量随碳酸铵浓度增加不断升高,这是由于碳酸铵提供了体系中丙酮醛氨解所需的NH3为4-MeI生成提供必要条件[27]。主要考虑4-MeI含量及红色素指数两个因素,选择3%、4%和5%三个碳酸铵浓度进行试验。

图3 (NH4)2CO3浓度对氨法焦糖色素品质的影响Fig.3 Effects of concentration of

2.2.4 葡萄糖浓度对焦糖色素的影响 由图4发现,葡萄糖浓度的变化对各评价指标的影响较小,且趋势与其它因素影响结果相似。葡萄糖浓度>500 g/L时,对色率的影响不显著。葡萄糖提供了反应所需的糖类物质,浓度增加会使反应产生的呈色物质增加,达到500 g/L浓度时反应物接近饱和,因此对色率无显著影响。红色素指数受葡萄糖浓度变化的影响不明显。当葡萄糖浓度在200～400 g/L时,4-MeI含量随葡萄糖浓度增加而加大;当葡萄糖浓度在500～700 g/L时,4-MeI含量不随葡萄糖浓度变化而变化。葡萄糖作为反应的主原料,随着浓度的增加会提高反应后各物质的产量,当原料浓度达到饱和后,对反应的影响并不明显,因此选择400、500和600 g/L进行单因素试验。

图4 葡萄糖浓度对氨法焦糖色素品质的影响Fig.4 Effects of concentration of glucose on caramel color quality

2.3 正交试验

2.3.1 因素水平选择 在单因素试验结果基础上,选择反应温度、反应时间、碳酸铵浓度、葡萄糖浓度进行四因素三水平试验,为减少误差特设误差列,选择L18(37)正交表进行正交试验设计(见表2)。并将优化结果与初始条件制备的焦糖色素进行比较,初始焦糖色素的色率6.32×104EBC,红色素指数5.07,4-甲基咪唑的含量256.63 μg/mL。

2.3.2 正交试验结果 按表1进行正交试验设计,结果见表2。

表2 焦糖色素氨法工艺优化L18(37)正交表试验结果表Table 2 Results of L18(37)orthogonal array design

2.4 方差分析

试验结果显示反应温度、反应时间、催化剂浓度对焦糖色素的色率、红色素指数和4-甲基咪唑含量影响较为明显,而葡萄糖浓度对焦糖色素品质影响不大。因此对各因素对不同指标的影响效果分别进行分析。以焦糖色率为因变量进行反应温度、时间、催化剂浓度和葡萄糖浓度的主体间效应检验,经检验分析发现各因素间无交互作用,采用单因素方差分析。

2.4.1 各因素对焦糖色素色率的影响 由表3可知:反应温度主体效应F值为349.566,p值为0.000,反应时间的p值为0.020,表明二者对色率影响显著(p<0.05);葡萄糖浓度和催化剂浓度的变化对色率均无显著影响(p>0.05)。同时,误差列对试验结果无影响。

表3 各因素对焦糖色素色率影响方差分析结果Table 3 Results of one-way analysis of variance

以焦糖红色素指数为因变量进行各因素主体间效应检验。结果见表4,反应温度对色率红色素指数影响显著(p=0.001),其余因素对焦糖色素红色素指数影响不大(p>0.05)。

表4 各因素对焦糖色素红色素指数影响方差分析结果Table 4 Results of one-way analysis of variance

经方差分析(结果见表5)可知:反应温度和碳酸铵浓度对焦糖色素中4-甲基咪唑生产的影响显著(p<0.05),反应时间和葡萄糖浓度对4-甲基咪唑生成无显著影响(p>0.05);各误差列对试验结果无影响。

表5 各因素对焦糖色素中4-甲基咪唑 含量影响方差分析结果Table 5 Results of one-way analysis of variance

根据方差分析可知,反应温度对三个考察指标均有显著影响(p<0.05),反应时间、碳酸铵浓度分别对色率、4-甲基咪唑含量具有显著影响(p<0.05)。由此可见,最优生产工艺的确定应主要对反应温度、反应时间和碳酸铵浓度进行筛选。焦糖色素作为一种天然色素在食品中添加使用,应以色率、红色素指数为主要考察,同时筛选出4-甲基咪唑含量低的优质产品。因为各因素对焦糖色素色率的影响趋势与各因素对红色素指数、4-甲基咪唑含量影响趋向相反，所以对最佳生产工艺的选择很困难。色率高要求高温长时间多葡萄糖进行反应，但温度过高导致焦糖色素颜色发黑，色调不好，同时还会促使4-甲基咪唑的生成；红色素指数高，色调好且4-甲基咪唑含量低的产品要求低温短时间反应，但是色率无法保证，又降低了焦糖色素的生产效率。

本工艺的优化不仅有效降低了4-甲基咪唑的生成,更对焦糖色素的感官、性状、色率、色调等天然色素的主要应用指标进行优化分析。

3 讨论与结论