刘晶晶,万红兵,丰永红,张松山,雷元华,谢 鹏,李海鹏,孙宝忠

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100000)

不同的加工过程形成不同的嫩度特性。影响嫩度的因素有很多,目前认为肌纤维、结缔组织、肌内脂肪是影响牛肉嫩度的最重要因素[1]。不同的烹饪方式,加热温度与时间的不同都会对牛肉品质产生不同的影响[2]。郎玉苗[6]研究发现,肌纤维走向对牛肉剪切力有着显著影响,平行于肌纤维走向的剪切力显著低于垂直于肌纤维走向。导致该差异的原因尚且未知,肌纤维和结缔组织是影响牛肉嫩度的最重要因素,结缔组织的主要存在形式肌内膜和肌束膜是由镶嵌在蛋白多糖基质中胶原蛋白和弹性纤维构成的复合网状结构形成的[7]。Lewis G J[5]研究发现肌内膜和肌纤维膜的性质相似,但二者变性温度不同。根据Bernal and Stanley[4]研究报道，牛肉嫩度与肌束膜的机械强度有关。L Christensen[3]认为胶原蛋白分子不同程度的共价交联造成结缔组织耐热强度不同。一些研究认为，随着动物年龄的增长,牛肉嫩度降低、剪切力增加的原因有很多,其中包括胶原蛋白的含量以及肌束膜厚度[8-9]。I. Girard等认为肌原纤维和肌束膜、肌内膜的结构完整性是影响熟肉嫩度的主要原因[10]，说明牛肉嫩度是肌纤维与结缔组织共同作用的结果。据Lewis[11]研究报道，将肉切成很薄的片状,顺着肌纤维方向切割的力量主要是由肌内膜-肌外膜联合主导,顺肌纤维方向切割一定厚度的肉块时,结缔组织中的肌内膜肌外膜形成的连续网络结构具有很高的强度,切割时无疑会需要更大的力。由此推测牛肉的剪切力大小与其几何结构有关。

本实验针对中国消费者的饮食习惯研究肌纤维走向对牛肉食用品质的影响,以使牛肉生产和加工满足中国消费者的需求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛半腱肌 选自同一育肥场、品种和饲养管理相同的河南夏南牛6头,24月龄。屠宰后牛半胴体在4 ℃冷库中成熟48 h后进行取样,从半胴体上取下整条左侧半腱肌,所选胴体其大理石花纹、生理成熟度和背标厚度等指标基本相似。真空包装,-20 ℃贮运。

浓硫酸、一水柠檬酸、氢氧化钠、无水乙酸钠、正丙醇、异丙醇、氯胺T、对二甲基氨基苯甲醛、4-羟基-α-吡咯甲酸、戊二醛、乙醇、丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺 分析纯,国药集团化学试剂北京有限公司。

TA-XT plus物性测试仪 英国Stable Micro System公司;电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司;FJ-200高速分散均质机 上海标本模型厂;数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;DHP-9052型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;6100型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;TGL16MB高速冷冻离心机 湘智离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 加热处理 取冻存肉样,在4 ℃条件下解冻24 h,去除肉块表面的皮下脂肪和肌外膜,切割成大小为2.5×5.0×5.0 cm的肉块若干并称重,分组,用蒸煮袋包装,分别在不同温度(60、70、80、90、100 ℃)水浴锅中加热,分别加热30、60、90、120、150 min,当达到规定时间后,立即取出,流水冷却至室温,用吸水纸吸干肉块表面汁液,称重,待分析。

1.2.2 剪切力值测定 取直径为1.27 cm的圆柱形空心取样器沿垂直于肌纤维方向和平行于肌纤维方向各取5个长条肉柱,使用TA.XY Plus物性测试仪的HDP/BS刀具进行检测,使长条肉柱较长边与刀口运动方向垂直,进而测定剪切力值。

1.2.3 质构剖面分析 取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm的肉丁按肌纤维垂直和肌纤维平行于托板的方向放置,以二次压缩模式进行质地剖面分析。对硬度、弹性、凝聚性、黏着性、胶黏性、咀嚼性和回弹性等7个指标进行测定。

质构分析参数设定如下:

测前速度:2.00 mm·s-1,测试速度:1.00 mm·s-1,测后速度:1.00 mm·s-1,压缩率:50%,两次压缩间隔时间:5.0 s,触发力:0.98 N,活塞:P/50,温度:20 ℃,数据获取率:200 PPS。

1.2.4 肌内结缔组织机械强度测定 结缔组织机械强度测定按照Nishimura[12]的方法,取1.0 cm×1.0 cm×1.5 cm肉柱,用2.5%戊二醛溶液固定三天,之后在10%NaOH溶液中浸泡5 d(每天换水2次),之后再在蒸馏水中浸泡5 d(每天换水两次),用乙醇除去肌束膜的脂肪,蒸馏水冲洗去除乙醇,最后将样品浸入7.5%丙烯酰胺(含过硫酸铵(1.5 mg/mL),立即加入TEMED(0.75 μL/mL)聚合3 h,用质构仪检测丙烯酰胺包埋的结缔组织机械强度。

1.2.5 羟赖氨酸吡啶啉HP和赖氨酸吡啶林LP的测定 用预冷的PBS(0.1 mol·L-1,pH=7.4)冲洗组织,称重后将组织剪碎,将剪碎的组织与对应体积的PBS加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨,最后将匀浆液于5000×g离心5～10 min,取上清检测。从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出板条,设置标准品孔和样品孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL,样品孔中加入待测样本50 μL,空白孔不加,除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物(HPR)标记的检测抗体100 μL,用封板膜封住反应孔,37 ℃恒温箱温育60 min,弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1 min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL,37 ℃避光孵育15 min,每孔加入终止液50 μL,15 min内,在450 nm波长处测定各孔的OD值。

1.2.6 扫描电镜观察 将所制备好的肉样切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉柱,于2.5%戊二醛中4 ℃固定3 d,然后用磷酸缓冲液(PBS)(pH7.4)清洗3次,每次30 min;用50%、70%、80%和90%的乙醇梯度脱水各15 min,100%乙醇脱水3次,每次30 min;样品脱水后,用叔丁醇置换3次,每次30 min;置换后的样品直接移到样品台上,冷冻干燥,随后用离子溅射仪给样品表面镀一层金属膜(10 nm),扫描电子显微镜(SEM)在电压为15.0 kV下放大500倍观察肌束膜和肌内膜结构的变化。

1.3 数据处理和统计分析

实验数据采用SPSS 22统计软件进行统计分析,处理组之间差异显著性分析采用邓肯氏多重比较法,数据采用“平均值±标准差”的表示方法,相关性分析采用Spearman相关系数分析法。

2 结果与分析

2.1 不同中心温度下不同肌纤维方向剪切力的变化

图1表示不同中心温度不同肌纤维方向下剪切力的变化。随着中心温度的升高,垂直于肌纤维方向与平行于肌纤维方向的剪切力在60～90 ℃呈上升趋势,当中心温度上升至100 ℃时剪切力均有所下降。加热至相同中心温度的牛肉平行肌纤维方向的剪切力显著低于垂直方向(p<0.05),随着中心温度的升高,平行肌纤维方向的剪切力依然显著低于对应中心温度的垂直于肌纤维方向的剪切力(p<0.05)。JA Boles[15]研究得出垂直于肌纤维方向的剪切力比平行于肌纤维方向的高50%。

图1 不同中心温度不同肌纤维方向下牛肉剪切力的变化Fig.1 Effects of different central temperatures on the shearing force of beef注:不同大写字母代表相同温度不同肌纤维走向剪切力 差异显著(p<0.05),不同小写字母代表不同温度 相同肌纤维走向剪切力差异显著(p<0.05)。

2.2 不同加热时间下不同肌纤维方向剪切力的变化

图2反映的是不同加热温度时间下不同肌纤维走向的剪切力,从图中可以看到，随着加热时间的延长,牛肉剪切力整体呈现下降趋势。相同加热温度时间下不同肌纤维走向的剪切力差异均显著,平行于肌纤维方向的剪切力显著低于垂直于肌纤维方向(p<0.05)。

图2 不同肌纤维方向下剪切力的变化Fig.2 Changes of shear force in different fiber directions注:不同大写字母代表相同温度相同加热时间不同肌纤维 走向差异显著(p<0.05)。图3、图5同。

2.3 不同肌纤维走向牛肉质构特性的变化

图3是牛半腱肌在60、80、100 ℃下加热30、60、90、120、150 min,分别对其按照垂直于肌纤维方向和平行于肌纤维方向进行质地剖面分析后得出的结果。从图3中可以看出,相同加热温度与时间下,平行于肌纤维方向的牛肉硬度、凝聚性均显著低于垂直于肌纤维方向(p<0.05),不同肌纤维走向下弹性、黏着性、胶黏性、咀嚼性有一定差异，表明不同肌纤维方向对肌肉的质构特性有一定影响,硬度、黏着性与咀嚼性都与肌肉剪切力密切相关,说明牛肉嫩度与质构特性密切相关。

图3 不同肌纤维走向对牛肉质构的影响Fig.3 Effects of different fiber directions on the texture of beef

2.4 不同肌纤维走向结缔组织机械强度的变化

由图4可以看到,牛半腱肌肉结缔组织机械强度随着加热时间的延长呈3阶段变化,在30～60 min,机械强度无显著变化(p>0.05);在60 ℃和100 ℃下，加热90～120 min,机械强度显著增加(p<0.05)；在80 ℃下，加热60～90 min，机械强度显著增加(p<0.05);120～150 min,机械强度显著降低(p<0.05),垂直于肌纤维方向的结缔组织机械强度显著高于平行于肌纤维方向(p<0.05),且变化趋势一致。

图4 不同肌纤维方向下牛肉结缔组织机械强度的变化Fig.4 Changes in connective tissue mechanical strength in different fiber directions注:不同大写字母表示不同肌纤维方向结缔组织机械强度 差异显著(p<0.05),不同小写字母表示延长 加热时间结缔组织机械强度差异显著(p<0.05)。

2.5 不同加热时间下胶原蛋白共价交联的变化情况

图5反映了不同加热时间下胶原蛋白共价交联的变化。图5A反映的是不同加热温度下延长加热时间羟赖氨酸吡啶啉(HP)的变化情况,图5B反映的是赖氨酸吡啶啉(LP)的变化情况。

从图5可以看出,各个温度下,随着加热时间的延长,羟赖氨酸吡啶啉的含量呈上升趋势,赖氨酸吡啶啉的含量大体呈下降趋势。牛肉在70、80、100 ℃下延长加热时间,羟赖氨酸吡啶啉HP的含量呈现部分组内差异显著(p<0.05);赖氨酸吡啶啉LP的含量在60、70、90 ℃下呈现部分组内差异显著(p<0.05)。说明加热温度与时间对牛肉共价交联量有明显影响。

图5 不同加热时间下胶原蛋白共价交联的变化Fig.5 Changes in collagen cross-linkig under different heating time

2.6 扫描电镜观察

Krystyna Palka[16]研究发现，结缔组织的粒化发生在60 ℃,温度越高,粒化越严重。图6分别是60、100 ℃下，延长加热时间肌肉横纵截面的扫描照片,从图6中可以看到，不同温度不同时间下结缔组织的变化情况,结缔组织的破损情况比肌纤维严重得多。随着加热的进行,可以看到肌束膜收缩,肌纤维束间空隙变大。随着加热温度的升高和加热时间的延长,各肌纤维之间空隙持续增大,肌内膜的完整性完全破坏,各肌纤维连接松散,从纵截面也可以看到单根肌纤维断裂,肌内膜破碎呈丝状。

图6 不同肌纤维方向牛肉微观结构变化(500×)Fig.6 Micro-structural changes of beef in different fiber directions(500×)

图6是按照垂直于肌纤维方向和平行于肌纤维方向切割肉样后对其截面进行扫描电镜观察,从图片中可以看到,沿着垂直于肌纤维方向切割牛肉时,肌纤维和结缔组织被完全切断。顺着平行于肌纤维方向切割牛肉时,从图片中几乎看不到单根肌纤维的断裂。

2.7 相关性分析

2.7.1 垂直于肌纤维方向的剪切力与牛肉质构特性的相关性分析 从表1可以看出，垂直肌纤维方向的剪切力与机械强度和咀嚼性呈极显著正相关(r=0.867，p<0.01；r=0.816，p<0.01)，与硬度和胶黏性和HP呈显著正相关(r=0.736，p<0.05；r=0.764，p<0.05；r=0.646，p<0.05)。

表1 垂直于肌纤维方向的剪切力与质构特性的相关性分析Table 1 Correlation analysis of shear force and texture properties perpendicular to the direction of muscle fibers

2.7.2 平行于肌纤维方向的剪切力与牛肉质构特性的相关性分析 从表2可以看出，平行于肌纤维方向的剪切力与硬度、凝聚性、胶黏性、咀嚼性、回弹性呈极显著正相关(r=0.673，p<0.01；r=0.820，p<0.01；r=0.658，p<0.01；r=0.652，p<0.01；r=0.791，p<0.01)，与机械强度呈现显著负相关(r=0.557，p<0.05)。

表2 平行于肌纤维方向的剪切力与质构特性的相关性分析Table 2 Correlation analysis of shear force and texture characteristics parallel to the direction of muscle fibers

3 结论与讨论

本实验研究发现,平行于肌纤维方向的剪切力显著(p<0.05)低于垂直于肌纤维方向,由扫描电镜照片可以看到,垂直切割时是将肌纤维和结缔组织完全切断,这时肌纤维与肌外膜、肌束膜和肌内膜共同决定了剪切力;平行于肌纤维方向切割时,从切割面几乎观察不到单根肌纤维的撕裂,肌纤维束之间可能只是发生了平行挤压,该过程或许会产生一定的阻力,并且由于在水平方向上结缔组织机械强度是存在的,所以这时可能是结缔组织起了关键作用,水平方向的剪切力可能由肌纤维的挤压力和结缔组织机械强度共同决定的,其力度远远小于将肌纤维和肌束膜完全切断的力。由图2和图3可以看到,平行方向的剪切力随着加热温度的升高和加热时间的延长降低幅度比垂直方向的大,可能是由于加热温度时间的升高延长使得胶原蛋白发生凝胶化,使肌纤维间的润滑度提升,使得剪切力减小,进一步说明平行方向的剪切力受结缔组织影响较大。

由质构分析知道,不同肌纤维走向对于牛肉质构特性(硬度、黏着性和咀嚼性)有一定的影响,但并不显著。硬度是指使样品变形所需要的力,黏着性是指食品表面与其他物体(舌、齿、腭等)粘在一起的力,咀嚼性指将固体食品咀嚼到可以吞咽时所做的功[18]。硬度和咀嚼性受肌纤维方向影响较大的原因经分析与剪切力一致。

本研究测定了牛半腱肌在60、80、100 ℃下加热不同时间下的结缔组织机械强度,测定过程中发现肌纤维结构弱化严重,结缔组织形态结构完整性保持较好,排除了肌纤维的干扰,使得实验结果在代表结缔组织的强度上具有专一性。垂直于肌纤维方向的结缔组织机械强度显著高于平行方向,说明肌纤维走向对结缔组织存在显著影响。结缔组织构成肉的硬度主要是通过胶原蛋白组成的肌束膜、肌内膜将肌原纤维连接形成有序的肌肉来实现的[17]。完整肌肉外围包裹着一层肌外膜,肌外膜向内延伸,把肌肉分成许多肌束,形成肌束膜,肌束膜进一步向内延伸包裹单根肌纤维,形成肌内膜。肌束的大小决定肉的质地,不同部位肉间肌纤维和结缔组织的含量差别很大,是造成硬度差异的重要原因。总的来说,结缔组织在结构上的延伸方向和肌纤维是一致的,但由于其复杂的网状结构,结缔组织在垂直于肌纤维方向上也有一部分延伸。在测定剪切力的过程中,垂直肌纤维切割牛肉的力度有一部分是由结缔组织提供的,这里的结缔组织含量多、机械强度大。虽然结缔组织在平行方向的剪切力度中占据了主导,但由于平行方向下的结缔组织含量低导致机械强度较小,所以平行于肌纤维方向的结缔组织机械强度较小,而垂直方向的机械强度较大。

胶原蛋白分子由三条左旋的蛋白质α-链组成,α-链进一步缠绕形成右旋的三重超螺旋结构。对于可溶性胶原,加热导致分子的三重螺旋解旋成单股,胶原分子的棒状结构就会变为线圈状结构,而相邻胶原分子间的共价交联就会限制这种转变[19],这些共价交联是由赖氨酸或羟赖氨酸的残基及它们的醛类物质缩合形成的。胶原蛋白之间的成熟交联为结缔组织提供其所需的物理化学性质和生物学稳定性[20]。在生肉中吡啶啉的数量与剪切力的大小无关,本研究中随着加热温度的升高、加热时间的延长,羟赖氨酸吡啶啉的含量呈递增趋势,而赖氨酸吡啶啉的含量呈下降趋势,原因可能是由于虽然HP和LP结构类似,但醛基酮途径形成的HP的热稳定性要比醛亚胺途径形成的LP的热稳定性要高。更值得注意的是,经过相关性分析可知,HP与剪切力呈显著正相关,与结缔组织机械强度呈极显著正相关,LP与结缔组织机械强度呈极显著负相关。说明胶原蛋白中羟赖氨酸吡啶啉的含量越高,结缔组织机械强度越大,HP具有较强的热稳定性,随着加热温度时间的增加,HP的相对含量增加,结缔组织机械强度增加,剪切力增加。胶原蛋白共价交联对牛肉嫩度有很大影响,羟赖氨酸吡啶啉的含量越高,结缔组织强度越大。有学者研究得出胶原蛋白间的共价交联与熟肉的嫩度并没有很强的相关性[21],经分析认为本研究中的高相关性可能与加热时间的长短有关。HP、LP对垂直方向的结缔组织机械强度影响比平行方向的大,原因可能是由于不同方向的结缔组织含量有差异。

结缔组织机械强度越大,肌外膜、肌束膜对肌纤维的包裹越紧密,肌纤维的排列越致密有序,肌纤维束之间的间隙越大,平行于肌纤维方向切割牛肉,挤压过程中被肌束膜包裹的肌束平行移动起来较为容易利落,且肌束间隙变大会使切割面摩擦力减小,从而使剪切力减小,也可能是由于结缔组织的凝胶化在肌纤维之间起到了一定的润滑作用,从而使得剪切力较小。垂直肌纤维方向的剪切力与硬度、胶黏性和咀嚼性呈显著正相关,平行于肌纤维方向的剪切力与硬度、凝聚性、胶黏性、咀嚼性、回弹性呈极显著正相关,说明不同肌纤维方向的牛肉嫩度与质构特性密切相关,其中胶黏性、硬度、咀嚼性对不同方向的剪切力有相同的贡献,而平行方向的剪切力与凝聚性和回弹性有很大关联,凝聚性对咀嚼有较强和持续的抵抗,回弹性指产品努力恢复到最初状态的能力,这一现象验证了平行方向的切割过程主要涉及到肌纤维的挤压和移位,其抵抗力来自于肌纤维和结缔组织的变形,该力度与直接将肌纤维和结缔组织切断所需要的力相比确实比较小,进一步解释了不同肌纤维方向下剪切力不同的原因。即垂直方向的嫩度特性由肌纤维和结缔组织共同决定,平行方向的嫩度特性由少数结缔组织和肌纤维变形挤压力决定。