孟祥敏，南海龙，丁鑫，郝建宇，薛海，文连奎

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

苹果梨为蔷薇科（Rosaceae）梨属果树的果实[1]，为白梨（Pyrus bretschneideri Rehd）系统中优质品种之一，产于我国吉林省延边朝鲜族自治州，果肉白色，脆嫩多汁，酸甜适口[2]。鲜梨果实中富含氨基酸、黄酮、碳水化合物、钙、磷、铁、胡萝卜素、维生素 B1、维生素 B2、维生素PP、维生素C等多种营养物质。现代研究表明苹果梨还具有润肺健脾、软化血管、和胃止呕止泻、消痰止咳等保键功能[3-5]。

苹果梨主要用于鲜食，因贮藏方式单一，贮藏量仅占产量3%[2]。目前有关苹果梨深加工的报道主要有苹果梨酒、苹果梨果冻、苹果梨果醋、苹果梨饮料、苹果梨脆片[6-10]等。苹果梨在加工过程中容易发生褐变，影响其风味、色泽。因此，当地人们将其冷冻为冰梨后食用，不仅风味独特，而且易贮藏。本研究以冰苹果梨为原料，研究其发酵酒工艺，为苹果梨深加工产品开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 原料与辅料

苹果梨：延边地区；白砂糖（食品级）：吉林省鸿海有限公司；安琪葡萄酒高活性干酵母（食品级）：湖北安琪酵母有限公司；柠檬酸（食品级）：长春健鹰食品添加剂公司。

1.1.2 药品与试剂

氢氧化钠、盐酸、酚酞：天津科密欧化学试剂有限公司；偏重亚硫酸钾、葡萄糖标准品：北京红星化工厂；硫酸铜、次甲基蓝等（分析纯）：北京化工厂。

1.1.3 仪器与设备

电子分析天平（AUY220）：Shimadzu Philippines公司；生化培养箱（SPX-250B-Z）：上海市博讯事业有限公司；电热恒温水浴锅（KW-1000DC）：金坛市科仪器有限公司；手持糖度计（WYT-4）：上海精密仪器仪表有限公司；酒精计：河间市仪器厂；pH计（PHS-3C）：上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 冰苹果梨发酵酒工艺流程

苹果梨→冷冻→解冻→压榨→加SO2抑菌→糖度调整→干酵母活化→发酵→过滤→陈酿→澄清→原酒

1.2.2 操作要点

苹果梨：果实中等大小，完全成熟且无虫害溃烂。

冷冻：采取室外阴凉处分散放置自然冷冻，从11月中旬至次年2月中旬，期间平均最高气温为-5℃，最低气温为-18℃，平均温差为13℃。

解冻：将苹果梨切块，在20℃下解冻30 min。

压榨：半解冻状态下压榨，丢掉残渣和冰渣，留取含糖量较高的冰苹果梨汁。

加SO2抑菌：加入50 mg/L的SO2。

调糖度：苹果梨自身含糖量在9 g/L～10 g/L，半解冻压榨后糖度为17 g/L～18 g/L，最终糖调整可溶性固形物为22 g/L。

干酵母活化：将酵母与2%的糖水以1∶10（质量体积比）的比例混匀，在38℃的温度下活化30 min，菌液活菌数约为8.2×107cfu/mL。

接种：按试验设计接种发酵。

发酵：将活化好的酵母菌加到调整好的苹果梨汁中，留少量空气提供酵母生长，按试验设计的温度和时间进行发酵，前期适度搅拌，后期保持无氧发酵。

过滤：将发酵残渣、沉淀物分离除去。

陈酿：在10℃～15℃下陈酿2个月。

澄清：12℃～15℃下放置6个月。

1.2.3 试验设计

以酒精度为指标，研究发酵温度、时间、pH值和酵母添加量对冰苹果梨发酵酒发酵效果的影响，进行单因素及响应面优化试验。

1.2.3.1 冰苹果梨酒发酵单因素试验

发酵时间：pH值调至4.0，接入0.5 g/L的活性酵母，在 18 ℃下分别发酵 16、18、20、22、24 d，确定最佳发酵时间。

发酵温度：pH值调至4.0，接入0.5 g/L的活性酵母，分别在 14、16、18、20、22 ℃的温度下进行发酵 22 d。

酵母添加量：pH值调至4.0，分别接入0.40、0.45、0.50、0.55、0.6g/L的活性酵母，在18℃下恒温发酵22 d。

pH值：接入0.5 g/L的活性酵母，将pH值分别调至3.6、3.8、4.0、4.2、4.4，在 18℃下恒温发酵 22 d。每组试验重复3次，取平均值。1.2.3.2 响应面优化试验

根据单因素的试验结果，利用响应面法选取发酵的pH值A（℃）、酵母菌接入量B（g/L）、发酵的温度C为3个因素，以酒精度为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面设计。

1.2.4 冰苹果梨发酵酒的理化指标

酒精度的测定：酒精计法；总糖、残糖的测定：斐林试剂直接滴定法；总酸、挥发酸的测定：酸碱中和滴定法；干浸出物的测定：密度瓶法[11]；pH值的测定：pH计法；可溶性固形物的测定：手持糖度计法；总二氧化硫、游离二氧化硫的测定：直接碘量法。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 发酵时间对冰苹果梨发酵酒的影响

发酵时间对冰苹果梨发酵酒的影响见图1。

由图1可知，酒精度随发酵时间的延长而增加到某一终点，由于发酵温度较低导致发酵速度缓慢，在发酵第22天时酒精度达到最高且保持稳定。因此发酵时间确定为22 d。

图1 发酵时间对冰苹果梨发酵酒的影响Fig.1 Effects of fermentation time amount on ice-pingguoli pears pall fermented wine

2.1.2 发酵pH值对冰苹果梨发酵酒的影响

发酵液的pH值直接影响着冰苹果梨发酵酒的品质，当pH值过低时会抑制酵母菌的活性，且影响发酵速度，而当pH值过高时，导致代谢酶系的活力降低[12]，pH值对冰苹果梨发酵酒的影响见图2。

图2 pH值对冰苹果梨发酵酒的影响Fig.2 Effects of pH on ice-pingguoli pears pall fermented wine

由图2可知，当pH值为3.8时，酵母代谢最旺盛，酒精度值达到最高，并随着pH值增大而降低，故选取pH值3.6、3.8、4.0继续进行下一步试验。

2.1.3 酵母添加量对冰苹果梨发酵酒的影响

酒精是酵母菌利用糖发酵而产生的，酵母菌的添加量直接影响酒精度的变化，活性酵母菌的添加量对冰苹果梨发酵酒的影响见图3。

图3 活性酵母菌的添加量对冰苹果梨发酵酒的影响Fig.3 Effects of yeast addition amount on ice-pingguoli pears pall fermented wine

由图3可知，当酵母添加量为0.5 g/L时刚好能够代谢完全，酒精度达到最高，当添加量超过0.5 g/L时，酵母自身消耗的糖分及其他营养物质增多，代谢的副产物也随之增多，会使其活性过早衰退。而当接种量过低时，糖分得不到充分转化，影响酒体发酵，故选取接种量0.45、0.5、0.55 g/L进行响应面试验。

2.1.4 发酵温度对冰苹果梨发酵酒的影响

发酵温度对冰苹果梨发酵酒的影响也很大，考虑到冰苹果梨香气本身较淡，所以发酵温度采用低温，发酵温度对冰苹果梨发酵酒的影响见图4。

图4 发酵温度对冰苹果梨发酵酒的影响Fig.4 Effects of temperature on ice-pingguoli pears pall fermented wine

由图4可知，发酵温度低导致发酵速度缓慢[13]，但是当温度在20℃时，酒精度达到最高12.2%vol，温度在18℃时，酒精度为11.9℃，为更多的保存原汁果香，故选取温度值18、20、22℃进行下一步试验。

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 回归模型的建立及显著性检验

根据单因素试验结果，选取发酵的pH值A（℃）、酵母菌接入量B（g/L）、发酵的温度C为3个因素，以酒精度为响应值通过Design Expert 8.0.6进行三因素三水平响应面试验，对数据进行处理分析，确定最佳发酵工艺。响应面试验因素水平表见表1，响应面优化试验设计及试验数据见表2，回归模型方差分析见表3[14-16]。

表1 响应面试验因素和编码水平Table 1 Factors and levels of response surface

表2 响应面优化试验设计及试验数据Table 2 Experimental design and results of response surface

续表2 响应面优化试验设计及试验数据Continue table 2 Experimental design and results of response surface

表3 回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model

利用Design Expert 8.0程序软件对表2中的试验结果进行回归分析，对各因素回归拟合后，得到酒精度对冰苹果梨发酵 pH（A）、酵母添加量（B）、温度（C）的二次多项回归方程：

对回归方程进行方差分析和显著性检验结果如表3可知，回归项中P＜0.000 1，说明所选模型差异极显著。失拟项P=0.332 9＞0.05，即失拟项差异不显著，表明该二次回归模型能够较显著拟合冰苹果梨发酵酒pH值、酵母添加量、温度对酒精度的影响，该模型能够代替试验结果进行分析。模型的相关系数R2=0.981 3，校正决定系数R2Adj（0.961 9＞0.80）且变异系数（CV）为1.31%，说明该模型只有3.81%的变异不能由该模型解释。说明模型拟合优度较好，可用来对酒精度的变化进行解释并对其进行预测。当P＜0.000 1时，说明对应的所对应的试验条件对酒精度的影响是极显著的；P＜0.05时，则对应试验条件为显著。由表3可得回归方程系数的显著性，酵母添加量（B）、pH值的二次项A、酵母添加量的二次项B对冰苹果梨发酵酒的酒精度具有极显著影响；温度（C）、pH（A）和酵母添加量（B）的交互项 AB、酵母添加量（B）和温度（C）的交互项BC、温度的二次项C对冰苹果梨发酵酒的酒精度有显著影响。

2.2.2 冰苹果梨发酵酒酒精度的响应面分析

利用Design Expert软件，得到相应的二次回归方程的等高线及其响应面图。响应面的曲面图代表着两个试验的交互作用，通过坡度的大小即可判断因素对响应值的影响程度。如图5～图7所示。根据模型所做的响应曲面及其相应的等高线图可评估各因素对冰苹果梨发酵酒酒精度的交互作用关系，其中酵母添加量对响应值酒精度的影响最大，温度次之，最后是pH值。

图5 pH值和酵母添加量交互作用对酒精度的影响Fig.5 pH and yeast addition amount interactions on alcohol content

图6 pH值和温度交互作用对酒精度的影响Fig.6 pH and temperature interactions on alcohol content

图7 酵母添加量和温度交互作用对酒精的影响Fig.7 Yeast addition amount and temperature interactions on alcohol content

由图5可知，当温度为18℃时，pH值在3.6～4.0、酵母添加量在0.45 g/L～0.55 g/L时，酒精度保持先升高后降低的趋势，酵母添加量对酒精度作用显著，发酵pH值对酒精度影响较小，pH值与酵母添加量交互作用显著，当pH值在3.8～3.9，酵母添加量在0.5 g/L～0.53 g/L时酶系活力增强，酵母菌生长最旺盛，发酵效果最好，酒精度达到最高值。

由图6可知，当酵母添加量为0.5 g/L时，随着pH值的增加和温度的提升，酒精度也逐渐增加，发酵温度对酒精度作用显著，pH值在3.8～3.9、温度在20℃～21℃时，发酵效果最佳，酒精度达到最高值，而随着pH值的升高，酒精度下降。

由图7可知，当pH为3.8时，随着酵母添加量的增加和温度的提升，酒精度也逐渐增加，酵母添加量对酒精度的影响较大，此时糖分得到充分的转化，酵母添加量在0.50 g/L～0.53 g/L时酒精度达到最高，温度对酒精度影响也很大，在20℃～21℃时，发酵效果最佳，酒精度达到最高值。

最优工艺条件的预测及验证运用Design Expert 8.0软件对试验数据进行优化预测，即对回归方程取一阶偏导数等于0，得到冰苹果梨发酵酒的最佳发酵工艺为：温度20.25℃，酵母添加量0.52 g/L，pH值3.79，在此条件下冰苹果梨发酵酒的酒精度为12.385 9%vol。根据实际试验可操作性，将冰苹果梨发酵酒加工工艺参数改为：温度为20℃，酵母添加量为0.5 g/L，pH值为3.8。在此条件下对模型的预测参数进行3次平行验证试验，得到冰苹果梨发酵酒酒精度为12.4%vol，与模型预测值较接近，表明采用响应面分析法优化得到的冰苹果梨发酵酒发酵工艺参数可靠。

2.2.3 冰苹果梨发酵酒的理化指标

经对发酵后的冰苹果梨酒的理化指标分析，其酒精度 12.4%vol；总糖（以葡萄糖计）＜7 g/L；总酸（以柠檬酸计）3 g/L；挥发酸（以柠檬酸计）1 g/L；总二氧化硫＜250 mg/L；游离=氧化硫＜50 mg/L；干浸出物20.1 g/L。

2.2.4 冰苹果梨发酵酒的感官指标

冰苹果酒体呈浅红棕色，澄清、无悬浮物，有苹果梨独特的清爽香气和酒香，入口醇厚，微酸爽口。

3 结论

通过单因素试验和中心组合设计试验，采用响应面分析法优化冰苹果梨发酵酒的发酵工艺条件，建立冰苹果梨酒发酵工艺的二次多项数学模型。该模型极显著，拟合情况好，可用来预测设定条件范围内及其周围的冰苹果梨发酵酒发酵工艺参数，有一定实用价值。各因素对冰苹果梨发酵酒发酵工艺的影响次序为酵母添加量＞发酵温度＞pH值，优化后工艺条件参数为温度为20℃，酵母添加量为0.5 g/L，pH值为3.8，发酵时间为22 d，在此条件下酒精度为12.4%vol，发酵所得的冰苹果梨发酵酒清香可口，具有独特的冰苹果梨风味。