李媛媛，欧雅文，崔羽，胡小松，廖小军，张燕

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，国家果蔬加工工程技术研究中心，北京100083）

随着生活水平提高，居民高脂肪、高蛋白饮食的 摄入使肥胖、高血脂等代谢疾病的发病率在全世界普遍上升[1－3]。为了降低肥胖发生率，缓解这一健康问题，2016年美国农业部和中国营养学会分别修订了各自的膳食指南，指南中均明确提出增加蔬菜的摄入量[4－7]。叶绿素作为绿色蔬菜中含量最为丰富的色素，其决定了果蔬的品质特征，同时国内外研究发现其还具有降低胆固醇、调节肠道功能、抗突变等生理功能[8-11]。近年来，随着深色蔬菜中的花色苷、多酚等非营养物质被深入研究，蔬菜摄入后的叶绿素的生物活性和营养价值引起了研究人员的重视，但目前人们对叶绿素的生物活性作用的理解还十分有限。

乳酸菌（Lactobaillus）是在自然界中广泛存在的一类可以发酵碳水化合物产乳酸的菌群，也是最早被利用于食物加工贮藏中的微生物之一[12]。Park等[13]研究发现微生物在体内作用的靶点为胃肠道，因此它对肠道菌群具有直接的调控作用。最新的研究表明在人体肠道菌群中乳酸菌具有改善肠道菌群结构、调节肠道菌群平衡、促进机体最大程度吸收营养物质，提高机体免疫力等有益的功能[13-14]。当给肥胖人群补充乳酸菌时，乳酸菌对肥胖人群肠道菌群的调节平衡作用，能够潜在的治疗肥胖及肾脏疾病[15]。在肠道中，乳酸菌通过产生的有机酸维持肠道酸性环境的稳定，并抑制有害菌的生长[16]。

因此，本试验在体外研究叶绿素的生物活性对乳酸链球菌（Lactic streptococci）的生长及代谢的影响，试图探索作为非营养物质之一的叶绿素是否能促进乳酸菌属中的乳酸链球菌种这类有益菌的生长，影响其产代谢物水平，进而起到促进乳酸链球菌调节肠道菌群，维持肠道菌群平衡的作用。此外，本试验为后续叶绿素和乳酸链球菌二者在体内协同发挥降低体重，有益健康的作用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

同一来源同一批次的新鲜菠菜（Spinacia oleracea L.）：中国农业大学家属区种植购买；乳酸链球菌（Lactic streptococci）：四川省微生物资源平台菌种保藏中心；色谱级甲醇、三氯甲烷、乙腈、正己烷：美国Thermo fisher公司；浓硫酸、95%乙醇等均为分析纯试剂，试验中所用的水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

CR21GⅢ型高速冷冻离心机：日本日立公司；DHP-9082恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；UV-1800紫外可见光分光光度计：日本岛津公司；JYDZ-31B九阳打浆机：九阳股份有限公司；Acquit UPLC液相色谱仪（UPLC）：美国Agilent公司；T6新世纪旋转蒸发仪：北京普析通用仪器有限责公司。

1.3 方法

1.3.1 叶绿素的制备

参照Rivera-Chávez等[17]的方法提取新鲜菠菜中的叶绿素。将洗净晾干的菠菜叶去梗，放搅拌机中，并倒入适量乙醇，搅拌成浆。按照料液比1∶3（g/mL）的比例再加入95%乙醇（体积分数），混匀后4℃，8 000 g条件下离心6 min，所得上清液在36℃水浴条件下旋转真空蒸发浓缩，静置过夜后去除上清获得叶绿素浓浆。叶绿素水平测定参照张雅婕[18]的方法并做修改，用移液枪吸取1 mL叶绿素浓缩液，梯度稀释100倍后分别在645、663 nm处测吸光度值OD，以80%丙酮（体积分数）为对照。叶绿素水平计算公式如下：

式中：Ca代表叶绿素a浓度，mg/L；Cb代表叶绿素b 浓度，mg/L；C 代表叶绿素总浓度，mg/L；A645代表样品在645 nm下的吸光值；A663代表样品在663 nm下的吸光值。

本试验中，得到叶绿素溶液平均浓度为7.8mg/mL。

1.3.2 菌种的活化和乳酸链球菌培养

参照Wolf等[19]方法，并稍作修改，进行菌种的活化。取1mL甘油贮存液菌种接入到19 mL营养肉汤培养基内，在37℃培养24 h，活化两代后，第三代活化至对数中后期，混匀后取适量菌液3 000 r/min离心10 min弃去上清液，用0.9%NaCl溶液还原至相同体积后，稀释10倍备用。

参照Prückler等[20]的方法并稍作修改。取出冷冻的1.5 mL乳酸链球菌EP管室温融化后，接种到20 mL液体厌氧培养管中，同时加入1 mL叶绿素粗提液，以不加叶绿素粗提液为空白对照，置于37℃的水浴摇床中（70 r/min）培养24 h，得到乳酸链球菌发酵液。

1.3.3 乳酸链球菌生长曲线的测定

参照Di Cagno等[21]的试验方法，每隔2 h用1 mL注射器吸取乳酸菌发酵液1 mL在紫外600 nm下测OD值，并记录试验数据，绘制乳酸菌生长曲线。

1.3.4 有机酸及短链脂肪酸测定

采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定有机酸、短链脂肪酸等乳酸菌代谢产物的变化趋势[22-25]。具体试验方法为：分别配制草酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、丙酸、正戊酸等标准品的系列浓度梯度，用0.22 μm的水相滤膜进行过滤，滤液用高效液相色谱法测定，定量分析后绘制标准曲线，用于后续有机酸和短链脂肪酸含量的计算。HPLC条件为：用超纯水作为流动相A，在13 mm水系滤膜下过滤后的0.005 mol/L H2SO4作为流动相B，等梯度洗脱，流速 0.5 mL/min，柱温 65 ℃，进样量 10 μL，检测波长为210 nm。

1.4 数据统计分析

每个试验重复至少3次，数据统计分析采用Statistix 8.1（分析软件，St Paul，MN）软件包中Linear Models程序进行，差异显著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Origin 8.1（Microcal Software，Inc.，Northampton USA）制图软件作图。

2 结果与分析

2.1 叶绿素对乳酸链球菌生长曲线的影响

叶绿素对乳酸链球菌生长曲线的影响见图1。

图1 乳酸链球菌生长曲线Fig.1 The growth curve of Lactic streptococci

如图1所示，叶绿素的添加能显著提高乳酸链球菌菌液的OD值（P＜0.05），且叶绿素对乳酸链球菌生长曲线趋势无影响，与对照组一致。0～2 h内是乳酸链球菌的急速增长期，乳酸链球菌OD值由0.62上升至0.89，上升43%。因此我们推测0～2 h为乳酸链球菌可以充分利用并消耗叶绿素而促进自身生长的最有效时期。

2.2 叶绿素对乳酸链球菌代谢物水平的影响

2.2.1 叶绿素对乳酸链球菌产草酸的影响

叶绿素对乳酸链球菌产草酸的影响见图2。

图2 叶绿素对乳酸链球菌产有机酸——草酸水平的影响Fig.2 Effect of chlorophyll on the content of organic acid（oxalic acid）by Lactic streptococci

由图2可知，和对照组相比，添加叶绿素后24 h内代谢物中草酸水平显著降低（P＜0.05），其中6 h～10 h内降低最为显著。Sasikumar等[26]研究发现乳酸菌可以降解草酸，降低人体肾脏草酸水平，减轻肾脏负担，同时增加尿液中的草酸的排泄。Mogna等[27]通过对比乳酸杆菌和双歧杆菌的降解草酸能力，得出了前者的草酸降解能力强于后者，有约68.5%的草酸铵盐能被其降解。本研究发现，和单独的乳酸链球菌相比，叶绿素的添加能显著降低草酸水平（P＜0.05），可能存在两方面原因，一是叶绿素促进乳酸链球菌的增殖，有效降解草酸。二是叶绿素可以提高乳酸链球菌降解草酸的能力，具体的原因还需要进一步研究。

2.2.2 叶绿素对乳酸链球菌产乳酸，柠檬酸水平的影响

乳酸链球菌进入肠道后，通过代谢产生乳酸和柠檬酸，可以有效的抑制有害细菌的增殖和生长，维持机内生态平衡和肠道的正常机能[12－13]。因此乳酸链球菌对肠道内菌群的组成和调节具有非常重要的作用，研究叶绿素对乳酸链球菌产生乳酸和柠檬酸水平的影响，有助于更好的了解其在肠道中的代谢情况。叶绿素对乳酸链球菌产乳酸，柠檬酸水平的影响如图3所示。

图3 叶绿素对乳酸链球菌产有机酸——乳酸、柠檬酸水平的影响Fig.3 Effect of chlorophyll on the content of organic acid（lactic acid and citric acid）by Lactic streptococci

由图3可见，添加叶绿素后，和对照组相比，在24 h内乳酸，柠檬酸水平显著提高（P＜0.05），其中柠檬酸含量提高达5%。柠檬酸、乳酸水平的升高，均能促进三羧酸循环和糖酵解过程[22]。柠檬酸可以直接参与三羧酸循环，而乳酸水平的升高可以逆反馈，抑制丙酮酸转化成乳酸；丙酮酸作为三羧酸循环的起始底物，丙酮酸水平增加又进一步促进柠檬酸水平的升高[28]。因此柠檬酸和乳酸水平的升高能促进能量代谢，从而促进机体对营养物质的吸收。Coda等[23]研究发现乳糖在乳酸链球菌的作用下，可以产生乳酸，柠檬酸等，降低生境内氧化还原电位和pH值，起到抑制部分致病菌、有害菌和腐败菌增长的作用。此外，乳酸链球菌能产生乳酸链球菌素，对大肠杆菌素和金黄色葡萄球菌素等具有一定的拮抗作用[14]。因此，将乳酸链球菌用于保健食品，可以增强机体对致病菌的抵抗力。本试验中发现添加叶绿素显著促进乳酸链球菌产乳酸、柠檬酸水平，说明叶绿素可以通过增加乳酸和柠檬酸水平对人体健康产生积极的作用。

2.2.3 叶绿素对乳酸链球菌产短链脂肪酸水平的影响

乳酸链球菌绝大多数代谢产物都对人体有益，尤其是短链脂肪酸，如乙酸与肥胖的相互作用，丙酸是糖酵解的底物，丁酸的抗癌作用[12]。添加叶绿素培养乳酸链球菌24 h后，检测乳酸菌短链脂肪酸的含量，结果如图4所示。

图4 叶绿素对乳酸链球菌产短链脂肪酸水平的影响Fig.4 Effect of chlorophyll on the content of short chain fatty acids by Lactic streptococci

图4为叶绿素对乳酸链球菌代谢短链脂肪酸的影响，其中主要检测到乙酸、丙酸和正戊酸。如图4（A）所示，和未添加叶绿素的对照组相比，添加叶绿素对乳酸链球菌产乙酸水平无显著性影响（P＞0.05）；但图4（B、C）中，添加叶绿素2 h后，和对照组相比，丙酸水平微量升高、正戊酸水平显著升高（P＜0.05）。添加叶绿素促进乳酸链球菌代谢产物丙酸、正戊酸水平升高，与乳酸链球菌OD值的增大呈现正相关，可能叶绿素通过促进乳酸链球菌数量的增加，促进其代谢产物的增加[8]。Kageyama等[29]进行动物实验研究表明，无菌小鼠肠道上皮细胞由于能量不足会发生自噬现象，影响上皮细胞的完整性，而添加丙酸后肠道细胞自噬现象消失，说明丙酸能给小肠上皮细胞提供能量，从而减少细胞凋亡。此外，丙酸还是糖酵解的底物，能有效促进糖酵解过程，促进能量代谢[15]。因此，添加叶绿素后增加乳酸链球菌产丙酸水平，有利于人体营养健康。Donohoe等[30]研究发现短链脂肪酸的种类和数量和人体健康具有一定的相关性。过敏性疾病患儿在早期与正常儿童肠道中的肠道菌群有明显差异，所以短链脂肪酸的种类和数量也表现出明显的差异，过敏性疾病患儿肠道中丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的水平均比正常儿童低。因此，建议多过敏性患者摄入叶绿素，促进体内短链脂肪酸的生成。

3 结论

本研究通过体外添加叶绿素培养乳酸链球菌发酵24 h，发现叶绿素的添加显著促进乳酸链球菌增殖，且0～2 h为乳酸链球菌的有效增殖期。此外，叶绿素促进乳酸链球菌产代谢物水平增加，其中有机酸水平上，草酸水平显著降低，乳酸、柠檬酸水平显著升高；短链脂肪酸水平上，正戊酸水平显著增加，丙酸水平轻微增加，乙酸水平则无显著性差异。综合以上结论本研究发现叶绿素影响了乳酸链球菌的生长及代谢，证明叶绿素具有一定的生物活性，可以和乳酸链球菌协同发挥促进健康的作用。