吉雪慧，张筠，*，刘术明，窦迎港

（1.黑龙江东方学院，黑龙江哈尔滨150066；2.黑龙江贝因美乳业有限公司，黑龙江安达151400）

仙人掌果（Opuntia ficus-indica）为仙人掌属（Opuntia）植物的果实。果浆肉质为红色或紫色，果肉可食，酸甜可口[1]。由于天然色素对人体无毒无害、营养价值高，而且具有一定的生物活性，因此，研究开发无毒无害的天然色素就成为了色素未来的发展趋势。花色苷是一类广泛存在于高等植物中的天然水溶性色素，存在于很多水果、蔬菜和花朵中，呈现红、蓝、紫或者黑的色泽[2]。具有一定的营养和药理作用，有较高的安全性能，而且具有抗突变、抗氧化、降血压、保护肝脏等保健功能[3-6]，被广泛用于功能性食品和保健品的原料和着色，含花色苷的植物提取物已被意大利、德国等国家的药典收载[7]。目前，仙人掌果除被当地老百姓少量采食之外，尚无他用。国内有关仙人掌的开发利用研究的报道较多，但有关仙人掌果的资料报道甚少。本研究在单因素试验基础上，基于响应面法（response surface methogology，RSM）研究提取温度、提取时间和乙醇提积分数对水提取仙人掌果中花色苷进行研究，并确定提取花色苷的条件，为进一步开发利用仙人掌果中花色苷提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海南野生仙人掌果；无水乙醇、氯化钾、浓盐酸、结晶乙酸钠（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；浓盐酸：天津市耀华化学试剂有限责任公司；其它试剂均为国产分析纯。

UV1800紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；FDU-1100型冷冻干燥机：日本东京理化仪器有限公司；JJ200型电子天平：美国双杰兄弟有限公司；GL-21M高速冷冻离心机：上海市离心机械研究所；Microstirrer6磁力搅拌器：意大利VELP。

1.2 试验方法

1.2.1 原料的预处理

仙人掌果洗净、去刺，取适量的仙人掌果原料放入榨汁机中，加水，打成浆，将其浆液倒入培养皿中，放入超低温冰箱中，使其温度冷冻至零下，放入真空冷冻干燥机中，待其水分被蒸发完全，粉碎机粉碎，过100目筛，装于密封袋中，4℃冷藏备用。

1.2.2 仙人掌果花色苷的提取

准确称取2.0 g原料粉末，加入锥形瓶中并添加一定量体积的乙醇溶液，放置磁力搅拌器中按照预先设定的温度条件预处理一定的时间，将其倒入离心管中以4 500 r/min的转速，离心15 min，取1 mL上清液于25 mL容量瓶中，分别加入10 mL的pH=1和pH=4.5的缓冲溶液，静置60 min后，用相应浓度的乙醇定容。用紫外分光光度计于530 nm处测量其吸光度[8]。用pH示差法计算仙人掌果花色苷的含量，计算公式[9]如下：

1.3 单因素试验

采用1.2.2设计的仙人掌果中花色苷的提取方法进行试验：固定提取时间为60 min，提取温度为60℃，乙醇体积分数50%3个因素，考察不同料液比[1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）]对仙人掌果吸光度的影响；固定料液比1∶25（g/mL），提取时间为60 min，乙醇体积分数为50%三个因素，考察不同提取温度（50、55、60、65、70 ℃） 对仙人掌果花色苷吸光度的影响；固定料液比1∶25 g/mL，提取温度为60℃，乙醇体积分数为50%3个因素，考察不同提取时间（50、60、70、80、90 min）对仙人掌果花色苷吸光度的影响；固定料液比1∶25（g/mL），提取时间为60 min，提取温度为60℃3个因素，考察不同乙醇体积分数（40%、45%、50%、55%、60%）对仙人掌果花色苷吸光度的影响。进行单因素试验，考察各因素变量对仙人掌果花色苷的吸光值的影响。

1.4 仙人掌果花色苷提取工艺优化试验设计

以料液比为1∶25（g/mL）进行试验，以530 nm吸光值为指标，对提取时间、温度、提取剂体积分数进行单因素试验。根据单因素的试验结果，采用Box-Behnken试验设计原理[10]，以提取时间、温度、提取剂体积分数为影响因素，设计三因素三水平的响应面试验。试验因素与水平如表1所示。

表1 因素水平表Table 1 Independent variables and levels for optimization

1.5 数据分析

应用spss 20.0进行数据分析，应用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 仙人掌果花色苷提取单因素试验

2.1.1 料液比对仙人掌果花色苷提取工艺的影响

料液比对仙人掌果花色苷提取工艺的影响见图1。

图1 料液比对仙人掌果花色苷提取工艺的影响Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on extraction yield of anthocyanins of cactus fruit

由图1可见，随着液料比的增大，提取液的吸光值也增加，当液料比达到1∶25（g/mL）时，吸光值最大。此后当溶剂用量继续增加，吸光值下降，表明花色苷提取率也在下降。这可能是由于色素在高浓度时分子之间存在自聚作用使其比较稳定，而增加溶剂时，色素浓度降低以致色素分子之间的作用力变弱，其稳定性下降而容易分解[11]，最后花色苷含量趋于平衡，说明色素已经基本提取出来。因此，应选择液料比为1∶25（g/mL），这样既有利于仙人掌果花色苷的提取，也利于减少后续浓缩步骤的成本。

2.1.2 提取温度对仙人掌果花色苷提取工艺的影响

即便如此，我仍固执地认为，像沙莉这样的“植物人”只能存活于自然经济社会，在现代商品社会里，终究会被类似于我这样更富斗争性的“猛兽”们淘汰出局。我暗下决心，一定要让她知道我的厉害！

提取温度对仙人掌果花色苷提取工艺的影响见图2。

图2 提取温度对仙人掌果中花色苷提取率的影响Fig.2 Effects of extraction temperature on extraction yield of anthocyanins of cactus fruit

由图2可见，在一定范围内，随着提取温度的增加，仙人掌果花色苷的提取率不断增加，当提取温度达到65℃时，提取率达到最大，随后再增加提取温度，提取率反而降低了。这是因为仙人掌果花色苷在低的温度中不容易浸出，在高温度下发生了降解，破坏了结构，导致吸光度减小。因此，选择提取温度为65℃，此试验结果与李媛媛[12]研究一致。

2.1.3 提取时间对仙人掌果花色苷提取工艺的影响

提取时间对仙人掌果花色苷提取工艺的影响见图3。

图3 提取时间对仙人掌果中花色苷提取率的影响Fig.3 Effects of extraction time on extraction yield of anthocyanins of cactus fruit

如图3所示，随着提取时间的增加，花色苷的提取率不断增加。当提取时间为70 min时，提取率达到最高。提取时间较短时，花色苷并未完全浸提，提取时间较长时，空气的氧化作用使花色苷成分分解进而产生褪色现象[13]。所以导致吸光度不高。因此选择提取时间为70 min，这与王红梅[14]在仙人掌果中提取黄酮物质工艺优化中的最佳提取时间相同。

2.1.4 溶剂体积分数对仙人掌果花色苷提取工艺的影响

溶剂体积分数对仙人掌果花色苷提取工艺的影响见图4。

图4 乙醇体积分数对仙人掌果中花色苷提取率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction yield of anthocyanins of cactus fruit

通过图4可知，随着乙醇体积分数的增加，仙人掌果花色苷的提取率增加，在50%乙醇溶液提取时，提取率达到最高，随后逐渐降低，同时也考虑到乙醇浓度越低，溶液沸点越高，不利于后期溶剂的回收处理[15]，故最佳的提取条件是乙醇体积分数为50%。

2.2 仙人掌果花色苷提取的最佳工艺参数

2.2.1 响应面试验模型的建立及其结果

根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验的基础上，选取提取温度（X1）、提取时间（X2）和乙醇浓度（X3）3个影响因素，采用三因素三水平的响应曲面试验设计对花色苷提取率（Y）进行优化[16]。按照Box-Behnken试验设计的统计学要求，对各项回归系数进行回归拟合，试验设计与结果见表2。

表2 试验设计与结果Table 2 Box-Behnken design with the observed responses

续表2 试验设计与结果Continue table 2 Box-Behnken design with the observed responses

利用Design-expert 8.0.6统计软件通过逐步回归对表2中的试验数据进行回归拟合，得到花色苷提取率对提取温度、提取时间、溶剂体积分数3个因素的二次多项回归模型：Y=289.44+5.84X1-37.91X2+17.50X3-0.65X1X2+2.47X1X3-11.17X2X3-56.95X12-81.34X22-39.02X32。对该模型进行方差分析，结果见表3。

表3 二次回归方程模型方差分析Table 3 ANOVA for the regression model

由表3可知，模型具有高度显著性（P<0.01），失拟项不显著（P=0.988 5>0.05）[17]，可知回归方程拟合度和可信度均很高，试验误差较小，故可用此模型对仙人掌果中花色苷提取的工艺结果进行分析和预测。根据统计学计算原理可知，回归方程相关系数R2为0.982 1，说明模型能解释98%响应值的变化，说明该模型与实际试验拟合程度良好[18]，用该模型对乙醇提取仙人掌果中花色苷的提取过程进行优化是合适的。

2.2.2 响应曲面分析与优化

根据回归方程，作响应面图和等高线图，考察所拟合的响应曲面的形状，分析提取时间、提取温度以及乙醇的体积分数对花色苷提取率的影响。模型的响应面和等高线图如图5、图6和图7所示。

图5 时间、温度对花色苷提取率影响的响应面和等高线图Fig.5 Response of contour plots and surface plots of the extraction yield under the interaction of temperature and time amount

依据各因素X1、X2和X3对响应值Y所构成的三维空间的曲面图，可反映各因素对其响应值的影响。等高线的形状能够反映这两种因素交互作用的强弱，结合对应的响应面图能够分析自变量对响应值的影响。当等高线越接近圆形，表明这两种因素对响应值的影响不显著，反之，越接近椭圆，对响应值影响越显著。响应面图可以比较直观的看出各因素对仙人掌果花色苷提取率的影响，曲线越陡峭，表明该因素对提取率的影响越大，响应值的变化越大[19-20]。由图5可知，提取温度和提取时间的曲面的坡度较为平缓，所以这两个因素对花色苷的提取率的交互作用不明显；由图6可知，乙醇体积分数和温度的响应曲面的坡度较陡，表明仙人掌果花色苷的提取率对乙醇体积和提取温度的变化较敏感；由图7可知，乙醇体积分数和提取时间响应面的坡度较平缓，说明乙醇体积分数和提取时间对花色苷提取率的响应值交互作用不明显。符合表2中对方程3个交互项的方差分析结果。因此，各影响因素对仙人掌果中花色苷提取率的影响不是简单的线性关系。为进一步确定最佳提取工艺参数，采用Design-expert 8.0.6统计软件对模型进行优化求解，可得最佳工艺参数为：提取温度57.48℃，提取时间70.59 min，乙醇体积分数51.32%，此仙人掌果花色苷的提取率为296.7 mg/100 g。

图6 乙醇体积分数、温度对色素提取率影响的响应面和等高线图Fig.6 Response of contour plots and surface plots of the extraction yield under the interaction of temperature and solvent amount

图7 提取时间、乙醇体积分数对色素提取率影响的响应面和等高线图Fig.7 Response of contour plots and surface plots of the extraction yield under the interaction of solvent and time amount

2.2.3 验证试验

最优工艺条件确定与模型验证通过Design-Expert.8.0.6软件对回归方程进行计算，得提取仙人掌果花色苷最佳工艺条件为：温度57.48℃，时间70.59 min，乙醇体积分数51.32%。由于对条件可操作性考虑，将最佳提取工艺条件修正为：温度55℃，时间70 min，乙醇体积分数51%，采用此提取条件进行验证试验，重复 3次，花色苷含量为（284±1.27）mg/100 g，与预测值296.7 mg/100 g相近。说明通过响应面优化后的提取条件参数可靠，具有一定的实践指导意义。

3 结论

在提取温度、提取时间和溶剂体积分数3个因素的基础上，采用响应面试验设计方法对仙人掌果中花色苷提取的工艺参数进行优化，确定最佳的提取工艺条件为：提取温度55℃、提取时间70 min、溶剂体积分数51%，此时仙人掌果花色苷的含量为296.7 mg/100 g。此工艺参数的确定可以减少工艺操作的盲目性，从而对后续仙人掌果花色苷精细加工提供理论依据。