王苗苗，韩飞，严欢，王红丽，李慕春

（新疆维吾尔自治区分析测试研究院，新疆乌鲁木齐830011）

5α-还原酶是一种微粒体酶，依赖还原型辅酶Ⅱ（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）为供氢体，将睾酮不可逆地转变为活性更强的、男性生长必需的二氢睾酮（dihydrotestosterone，DHT）[1-2]。但高水平的二氢睾酮容易引起雄激素依赖型疾病，如雄激素性脱发、良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）和前列腺癌等[3-4]。因此，目前通过抑制5α-还原酶来下调雄激素水平已成为治疗雄性脱发、前列腺增生等雄激素依赖型疾病的重要方法。相比其他雄激素拮抗剂，5α-还原酶抑制剂在选择性阻断二氢睾酮合成的同时，不影响睾酮的正常水平和生理功能。故以抑制5α-还原酶活性为靶点，筛选各种来源的5α-还原酶抑制剂的相关研究工作亦是目前药物开发的热点之一[5]。

5α-还原酶有3种同工酶，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型5α-还原酶受SRD5A1基因编码，由259个氨基酸组成，最适 pH6～pH8.5；Ⅱ型 5α-还原酶受 SRD5A2 基因编码，由24个氨基酸组成，最适pH5～pH5.5[6-7]。Ⅰ型5α-还原酶存在于皮肤皮脂腺、汗腺、毛乳头细胞、成纤维细胞、表皮角质形成细胞、毛囊角质形成细胞等皮肤组织中。而Ⅱ型5α-还原酶主要存在于前列腺、生殖皮肤、附睾、精囊等组织中[6-8]。III型5α-还原酶目前研究较少，在良性前列腺组织中呈低表达，在难治愈的前列腺癌中过度表达，可将睾酮转化为二氢睾酮，最适pH6.9[9]。目前已有的一些5α-还原酶抑制剂，如非那雄胺、度他雄胺、依立雄胺，已广泛用于临床上。非那雄胺是美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的第一个 5α-还原酶抑制剂药物，主要选择性地抑制Ⅱ型5α-还原酶，用于治疗前列腺癌、良性前列腺增生和雄激素性脱发。度他雄胺对Ⅰ型和Ⅱ型5α-还原酶无选择性。依立雄胺选择性和非竞争性地抑制Ⅱ型5α-还原酶。但这3种药物都有较强的不良反应，如易致勃起功能障碍、性功能异常、性欲降低、男性乳房女性化等[10-11]。因此，从天然植物中寻找高效、低毒的新型5α-还原酶抑制剂十分必要。

5α-还原酶抑制剂按来源一般分为3类：中草药来源的成分、微生物来源成分及化学合成的化合物[12]。其中，中草药5α-还原酶抑制剂作为天然植物来源，无明显不良反应，且来源广泛，因此，在治疗和预防良性前列腺增生（BPH）和前列腺癌等疾病方面具有良好的应用前景[13]。对5α-还原酶有抑制作用的天然成分主要为黄酮类、丙素类、酮类、萜类、甾体类和鞣质类化合物[14]。本课题组前期研究发现薰衣草正丁醇组分生物活性较其他组分高，故本研究以薰衣草正丁醇组分提取物为研究对象，采用超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）建立了 5α-还原酶抑制剂体外筛选模型，来考察其对5α-还原酶的抑制活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

薰衣草：由伊犁紫苏丽人有限责任公司提供，经新疆分析测试研究院阿依古丽副研究员鉴定确认；Lowry法蛋白质含量测定试剂盒、睾酮（分析纯）、非那雄胺（分析纯）：南京森贝伽生物科技有限公司；还原性辅酶Ⅱ（NADPH）：上海碧云天生物技术有限公司；三羟甲基氨基甲烷[（1，1，1-tris（hydroxymethyl）-methanamin，Tris]：天津市福晨化学试剂厂；苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）：上海麦克林生化科技有限公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：Fisher公司；其余化学试剂均为国产分析纯，实验用水为去离子水。实验动物：雄性SD大鼠40只，SPF级，体重180 g～220 g，新疆大学动物实验中心提供（合格证号SCXK（新）2016-0020）。

1.1.2 仪器设备

紫外分光光度计（UV-2700）、制备液相色谱仪（LC-20AP）：日本岛津公司；碎样机（RT-02A）：北京开创同和科技发展有限公司；电子天平（TE612-L）：赛多利斯科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅（HHS）：上海博迅实业有限公司；冷却水循环机（H50）：莱博科泰公司；超高效液相色谱仪（ACQUITYUPLC）：美国Waters公司；实验室冷冻干燥机（ALPHA2-4/Ldplus）：德国CHRIST 公司；分析天平（ME204）：梅特勒-托利多；联用型平行蒸发仪（Multivapor P12）：瑞士步琦公司；超纯水系统（MINI-QACHANLAGE A10）：美国密理特公司；石英比色皿：大连市日普利科技仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 薰衣草提取物制备

取薰衣草干花适量，用碎样机粉碎，过筛，保存备用。称取粉碎后的样品于锥形瓶，加入70%的乙醇（料液比 1 ∶10，g/mL），80 ℃回流提取 1 h，过滤，重复提取2次，合并2次滤液，减压浓缩至无醇味，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取得5个组分，减压浓缩后冻干，称重，保存；将这5个组分分别进行总黄酮含量的测定，选出最优组分为薰衣草正丁醇组分，以正丁醇组分进行试验，其余组分保存以备后用；取适量薰衣草正丁醇组分提取物加甲醇超声溶解，定容，进制备液相（YMC C18柱，流动相：乙腈-0.2%甲酸水溶液，50 min）按时间收集，得50个组分，浓缩，冻干称重；取适量甲醇溶解，定容，放于4℃冰箱保存，作为进行5α-还原酶抑制活性测定的样品溶液。

1.2.2 Ⅰ型及Ⅱ型5α-还原酶的制备及定量

1.2.2.1 制备

制备方法参考文献[15]，取雄性SD大鼠40只，禁食不禁水过夜后处死，迅速取肝脏及附睾（剥离脂肪组织），称重，生理盐水漂洗，剪碎，加入5倍量预冷的匀浆液[1 mmol/L PMSF、1 mmol/L DTT、10%甘油、1 mol/L Tris－HCl缓冲液，pH 值分别为 7.5，5.5[肝脏中富含Ⅰ型酶，三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液pH=7.5；附睾中富含Ⅱ型酶液，三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液pH=5.5]在玻璃匀浆器中匀浆。匀浆液于4℃及3 000 g离心10 min，取上清液，再以4℃及10 000 g离心60 min，取上清液即为粗酶，分装，保存于－80℃超低温冰箱中，临用前取出。

1.2.2.2 定量

采用Lowry法蛋白含量检测试剂盒测定蛋白含量，以粗酶中的总蛋白含量表示5α-还原酶的浓度，操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.3 薰衣草提取物对Ⅰ型及Ⅱ型5α-还原酶的抑制活性研究

方法参考文献，反应体系含有50μL提取液、300μL 1 mol/L Tris-HCl缓冲液[Ⅰ型酶液用三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液pH=7.5，Ⅱ型酶液用三（羟甲基）氨基甲烷盐酸缓冲液 pH=5.5]、50 μL 1 mmol/L的睾酮、50 μL 2.5 g/L 的非那雄胺、500 μL 酶溶液，加入1 mmol/L NADPH 100 μL后反应开始[15-16]。混合溶液37℃温育60 min，加入1 mL预冷甲醇终止反应，混匀，10 000 r/min离心5 min，取上清液并用0.22 μm滤膜过滤，供检测睾酮剩余浓度，反应体系见表1。

表1 5α-还原酶的抑制活性研究反应体系Table 1 Reaction system for inhibition activity of 5α-reductase μL

续表1 5α-还原酶的抑制活性研究反应体系Continue table 1 Reaction system for inhibition activity of 5αreductase μL

用超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）系统分析检测睾酮的含量，仪器条件如下：YMC-Triart C18（100 mm×2.0 mm，1.9 μm）；柱温为 30℃；流动相：乙腈-水（70/30，体积比）；流速0.2 mL/min；检测器为紫外检测器，242 nm。配制不同浓度的的睾酮溶液进行液相色谱分析，作标准曲线。

2 结果与分析

2.1 Ⅰ型及Ⅱ型5α-还原酶粗酶浓度结果

以牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）的浓度（X）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标得出BSA标准曲线见图1。

图1 BSA标准曲线Fig.1 The standard curve of the BSA

由图1可知，BSA标准曲线为Y=0.7875X+0.0657，R2=0.999。经计算肝脏中粗酶浓度为22.42 g/L（Ⅰ型酶），附睾中粗酶浓度为1.78 g/L（Ⅱ型酶）。

2.2 薰衣草提取物对Ⅰ型及Ⅱ型5α-还原酶的抑制结果

配制 0.29、0.58、1.44、2.88、5.77、14.42、28.84 mg/L的睾酮溶液进行液相色谱分析，以浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，制作睾酮标准曲线。睾酮的标准曲线为 Y=9 175 441.97X+4 165.42，R2=0.999，表明睾酮在0.29 mg/L～28.84 mg/L与峰面积具有良好的线性关系，可以用于含量测定。睾酮标准溶液的液相色谱图见图2。

通过色谱测定反应液中睾酮的含量，抑制活性的强弱用抑制率表征，如下式所示：

图2 睾酮标准图谱Fig.2 UPLC chromatogram of testosterone standard

抑制率/%=（空白管睾酮浓度的变化值－样品管睾酮浓度的变化值）/空白管睾酮浓度的变化值×100

样品对Ⅰ型及Ⅱ型5α-还原酶的抑制活性见表2、图 3、图 4。

表2 样品对Ⅰ型及Ⅱ型5α-还原酶的抑制活性数据表Table 2 The inhibitory activities towards the two 5α-reductase isozymes

续表2 样品对Ⅰ型及Ⅱ型5α-还原酶的抑制活性数据表Continue table 2 The inhibitory activities towards the two 5αreductase isozymes

图3 提取物对Ⅰ型5α-还原酶的抑制作用Fig.3 Inhibitory activities of plant extracts in vitro against 5α-reductaseⅠ

图4 提取物对Ⅱ型5α-还原酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory activities of plant extracts in vitro against 5α-reductaseⅡ

由图3、图4及表2可知，大部分薰衣草正丁醇提取物对Ⅰ型5α-还原酶（肝脏）表现出了抑制作用，其中20、43、44、50号提物作用较为显著；除薰衣草正丁醇提取物21、35、44号样品外，其余样品均对Ⅱ型5α-还原酶（附睾）表现出了抑制作用，其中43号提取物作用较为显著；同时也可看出薰衣草正丁醇提取物对Ⅰ型5α-还原酶的抑制作用明显高于对Ⅱ型5α-还原酶的抑制作用。

综上所述，薰衣草正丁醇提取物有39个样品对Ⅰ型5α-还原酶有抑制作用，有48个样品对Ⅱ型5α-还原酶有抑制作用，虽然对Ⅱ型5α-还原酶抑制作用较广泛，但对Ⅰ型5α-还原酶的抑制作用强（抑制率>50%）的样品个数更多。

3 结论与讨论

目前报道的5α-还原酶抑制剂体外筛选方法有放射性同位素法、紫外分光光度计法、气相色谱-质谱法和高效液相法等，各方法中酶的制备方法、检测原理和数据分析手段相似。各筛选方法的具体特点表现为：放射性同位素法灵敏度高，效率高，但因涉及放射性危险，需要检测同位素的专有仪器，方法开展场地受限；紫外分光光度计法利用分光光度计来检测结果，仪器易获取、操作简单快捷、经济实用，避免了放射性危险因素，缺点是由于NADPH是许多酶的辅酶，所以在5α-还原酶纯度不高的情况下，实验结果易受到其他酶影响导致准确度下降；气相色谱-质谱法检测准确度较好，干扰较少，但需要大型的专有仪器，方法开展也受限；高效液相法5α-还原酶抑制剂体外筛选模型在借鉴分光光度计法和同位素法的基础上，通过液相色谱仪进样，使5α-还原酶抑制剂体外筛选过程程序化，准确度高，重复性好，干扰少，同时，克服了同位素法存在放射性危险这一弊端，缩短了药物筛选周期，提高工作效率。

在本研究中，采用（ultra performance liquid chromatography，UPLC）法建立了稳定的5α-还原酶抑制剂的体外筛选模型，研究发现，薰衣草正丁醇部分20、43、44、50号样品均为潜在5α-还原酶抑制剂（对Ⅰ型5α-还原酶的抑制率分别为54.02%、58.79%、57.74%、53.73%，对Ⅱ型5α-还原酶的抑制率分别为30.88%、59.94%、-0.06%、26.12%），这可能导致发展新的天然药物治疗雄激素相关疾病，但提取物中的物质尚未完全清楚，有必要进行进一步的标准化植物成分的识别，此外，其可能的作用机制尚未明朗，还需要通过进一步的研究探索。