周展新 尹晓华 谢黎明 叶东梅 肖玄 李娜 张志伟

[摘要]目的：选取课题组前期鉴定的胃癌相关蛋白质TP53，了解该蛋白在胃腺癌组织中的表达情况，并分析其临床意义。方法：采用胃癌组织芯片结合免疫组织化学染色分析TP53蛋白在胃癌组织中的表达。依据免疫组织化学染色检测胃癌组织中的表达结果，结合患者的临床资料，分析TP53蛋白表达与临床资料两者间的意义。结果：1、TP53蛋白主要表达于细胞核，其在不同组织中的表达率分别为正常胃粘膜2.82%、癌旁组织18.43%、胃癌62.39%、淋巴结转移癌组织80.23%。胃癌组织中的阳性表达率分别为高分化腺癌54.22%、中分化腺癌62.5%、低分化腺癌79.49%。2、胃腺癌与淋巴结转移癌组织中TP53蛋白呈现高表达，且明显较正常胃粘膜及癌旁组织中表达高（p<0.01）。癌旁与正常胃粘膜组织中TP53蛋白呈现低表达，但癌旁组织中表达较正常胃粘膜组织高（P<0.01）。3、胃腺癌组织分化程度的降低，TP53蛋白阳性表达率逐渐增加（P<0.Ol）。TP53蛋白在胃腺癌组织中的表达与组织分化程度呈负相关，而与TNM分期及淋巴结转移呈正相关（P[关键词]胃癌；TP53蛋白；蛋白表达；临床意义

胃癌（Gastric carcinoma，GC）是我国人群中发病率与死亡率为第二位的恶性肿瘤，居消化道肿瘤之首[1-3]。最近，我国胃癌的发生率逐年降低，仍是严重威胁人们健康与生命的常见恶性肿瘤[4，5]。因为胃癌部位隐蔽，早期症状不明显，许多患者就诊时已发展为晚期，临床疗效差，所以胃癌早期诊断对其防治显得十分重要，提高其早期诊断依赖于新的技术发现。本研究选取课题组前期鉴定的胃癌相关蛋白质TP53[6]，进一步观察其在胃癌组织中的表达情况与临床意义，将为胃癌的诊断与鉴别，以及评估患者预后等提供相关的参考资料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 收集2013年5月到2016年5月237例南华大学附属第一医院胃癌手术切除标本，其中男性患者175例，女性患者62例；最大年龄者86岁，最小者27岁，平均年龄60岁；发生淋巴结转移患者169例，无转移患者68例；依据2010年版WHO分级标准，其中高分化腺癌者39例，中分化腺癌者113例，低分化腺癌者85例。按2009年版UICC/AJCC分期方案，其中I期33例，Ⅱ期55例，III135例，Ⅳ14例。另外，选取癌旁组织（距肿块2cm以内组织，为肠上皮化生，非典型性增生，粘膜慢性炎症）237例，选取正常组织（距肿块10厘米以上组织，可伴轻度炎症细胞浸润，无肠上皮化生及非典型性增生）148例，选取转移淋巴结组织（淋巴结中见癌组织）88例。患者术前均未接受过放化疗，所有组织均经病理确诊组织学类型。

1.1.2 主要试剂 实验所用的TP53蛋白鼠抗与羊抗鼠二抗为Santa Cruz公司产品。S-P免疫组化与DAB检测试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 参考S-P免疫组化试剂盒说明书步骤进行操作，实验设立阳性与阴性对照（阳性对照由公司提供，阴性对照设置由PBS代替一抗体）。具体操作步骤如下：二甲苯进行组织芯片充分脱蜡，PBS浸泡；经梯度酒精水化，加热抗原修复，PBS浸泡，过氧化物酶孵育，PBS浸泡，血清封闭，TP53蛋白一抗（1：500）4℃孵育过夜，PBS浸泡，二抗（1：1000） 37℃孵育15min.PBS浸泡，生物素蛋白一过氧化物酶抗体孵育，PBS浸泡，经DAB孵育组织显色，苏木素细胞核复染，盐酸乙醇分化，返蓝、脱水、透明、封片，显微镜下观察染色情况及阳性反应部位。

1.2.2 结果的判别 观察组织芯片中染色情况，组织中蛋白表达显色部位与阳性表达细胞数。蛋白表达染色情况分为黄色、棕色及棕褐色。蛋白表达显色部位为细胞核。观察TP53蛋白表达的阳性细胞数，通过随机选取每个芯片组织块5个不同视野，对视野中表达阳性细胞和所有细胞分别进行计数，每个视野重复计数三次，取5个视野平均值代表相应细胞数，计算蛋白在组织中的阳性表达率。依据蛋白表达染色强度与阳性表达率综合分值分析，蛋白表达染色强度计分，其中1分表示无色，2分表示黄色，3分表示棕褐色；阳性表达率计分，其中<10%计1分，11%-50%计2分；>50%计3分。综合分值—蛋白质染色强度计分×阳性表达率计分，其中1分为阴性“一”，2-4分为阳性“+”，>6分为强阳性“+++”，另外，视野中阳性细胞比例超过10%则表示为阳性。

1.2.3 统计学分析 所有数据采用SPSS 20.0统计分析软件进行数据的统计学分析，蛋白表达与不同临床病理资料分析用x2检验和方差分析，TP53蛋白表达的组间相关性分析用Spearman秩检验进行分析比较，以P<0.05表示资料分析差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TP53蛋白在胃癌组织中的表达情况 免疫组织化学染色结果显示，TP53蛋白表達于细胞核中，其在正常胃粘膜阳性表达率为2.82%、癌旁组织为18.43%、胃腺癌为62.39%、淋巴结转移癌为80.23%。胃腺癌与淋巴结转移癌组织中TP53蛋白呈现高表达，且明显较正常胃粘膜及癌旁组织中表达高（P<0.01）。癌旁与正常胃粘膜组织中TP53蛋白呈现低表达，但癌旁组织中表达较正常胃粘膜组织高（P<0.01）。TP53蛋白在高分化腺癌阳性表达率为54.22%、中分化腺癌为62.5%、低分胃腺癌为79.49%，随着胃腺癌分化程度的降低，TP53蛋白的阳性表达率则逐渐升高，胃腺癌组织分化程度的降低，TP53蛋白阳性表达率逐渐增加（P<0.01）。

2.2 TP53蛋白表达的临床意义结合临床病理资料结果分析，随着胃癌的演进TP53蛋白表达在组织中的变动不断升高，即在胃癌发生、发展过程中TP53蛋白阳性表达率逐渐增加。另外，TP53蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤大小均无关，其在胃腺癌组织中的表达与组织分化程度呈负相关，而与TNM分期及淋巴结转移呈正相关（P<0.01）。

3 讨论

目前，胃癌的发病机制研究及临床疗效方面取得了一定的成效，但早期诊断与治疗仍是改善胃癌疗效的重要举措，早期诊断依赖于灵敏与特异性高的诊断技术发现。寻找胃癌诊断特异与敏感蛋白质，对患者早期诊断与治疗意义重大，也对胃癌的防治具有深远的临床意义。经大量的研究后，人们归纳肿瘤标志物主要分为细胞表面相关标志物、血清相关标志物以及基因相关标志物三大类[7]。为了获取新的有价值的胃癌相关蛋白质，课题组前期从正常胃粘膜、癌旁（非典型增生、肠上皮化生组织）、胃腺癌及淋巴结转移癌组织中，筛选与鉴定了包括TP53蛋白在内的243个胃癌相关蛋白质，进一步分析所获相关蛋白质在胃腺癌组织中的表达意义，生物学功能及表达与调节机制等可为挖掘胃癌发病的分子机制提供理论依据。因此，本研究通过组织芯片大样本检测相关蛋白质的表达情况，分析其表达情况及临床意义。

TP53是一种重要的抑瘤基因，该基因定位于染色体17p13.1区域，含有11个外显子，编码53kD的蛋白质p53，其由393个氨基酸残基组成[8]。p53蛋白是人体细胞中非常重要的核转录因子，被称为“基因守护者”[7]。TP53在细胞内主要通过监测Gl和G2/M检测点调节细胞周期，与其转录激活密切相关[10]。野生型p53蛋白含量低，半衰期短，容易水解，一般情况下无法检测到。然而，突变型p53蛋白不易被水解，在细胞内不断积聚，容易检测。突变型p53蛋白则丧失了原有蛋白的抑癌作用，并获得了一系列癌基因的功能，如促进细胞恶性转化，加快细胞的生长增殖，诱导细胞产生耐药等。

许多研究发现，TP53基因在多种恶性肿瘤中发生基因突变，如肺癌、肝癌、结直肠癌等。目前，发现TP53基因的点突变至少有3500种，在肿瘤中的突变取决于种类、性质与位置，其点突变以错义突变为主，其突变位点主要包括175、248、249、273与282等氨基酸位点，产生突变体蛋白。有研究显示，TP53在肺腺癌组织中突变率为63.3%，与肿块大小和病理分期有关。TP53基因突变情况是判断淋巴瘤和血液病预后的重要指标之一，突变者预后差，容易复发与耐药等[6]。本研究检测为突变型TP53蛋白，其在胃癌及淋巴结转移癌组织中呈现高表达，其表达与胃癌的分化程度、肿瘤的TNM分期及淋巴结转移呈正相关，提示TP53基因在胃癌组织中丧失了抑瘤基因功能，扮演着促进细胞增殖作用。与其他肿瘤检测相似，检测TP53表达有助于胃癌组织的鉴别。

总之，本文通过运用胃癌组织芯片结合免疫组织化学染色分析了TP53蛋白在胃腺癌组织中的表达，以及与临床病理资料间的关系，明确了检测TP53蛋白表達有助于胃癌诊断的鉴别。证实了TP53蛋白在胃癌及淋巴结转移癌组织中高表达与胃癌的发生和组织学类型有关。本文为获取有价值的胃癌诊断相关蛋白质提供了有利的实验资料与依据，也为深入挖掘胃癌发病的分子机制提供了新的思路。

参考文献

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