佟延南 李芳远 李忠琴 赵光军 李高俊 王德强

摘要：【目的】动态分析不同养殖阶段罗非鱼肠道微生物的多样性，为科学利用益生菌对罗非鱼肠道和养殖环境中微生态结构进行定向改良提供理论依据。【方法】分别于罗非鱼养殖周期的前期（C1，4月）、中期（C2，6月）和后期（C3，8月）采集罗非鱼肠道样品，以试剂盒提取肠道总细菌DNA，经PCR扩增后对16S rDNA的V3～V4区进行高通量测序，并对肠道微生物进行物种组成差异分析。【结果】各样品测序中Tag数量平均为60694条，测序长度平均为440 bp，OTU Shannon稀释曲线趋于平缓并达到平台期；平均OTU数量排序为C2期（9376.125）>C3期（8591.375）>C1期（6567.667），chao1、ACE、Shannon和npShannon指数也表现出相同规律，但Simpson指数的排序为C2期（0.0405716）C3期>C1期。在各养殖阶段微生物种群数量占2.00%以上有11个门和14个属，优势菌群有所差异，随养殖周期的推移，乳球菌属所占比例逐渐下降，芽孢杆菌属、假单胞菌属和分支杆菌属呈先增后减的变化趋势，梭菌属和邻单胞菌属在养殖前期所占比例最高。此外，不同地区相同养殖阶段的罗非鱼肠道微生物丰度差异标记类群存在一定差异，但也存在相似之处，如养殖前期以栖水菌属最具代表性，中期主要以芽孢杆菌科丰度最高。【结论】不同养殖阶段的罗非鱼肠道微生物组成差异明显，且不同地区相同养殖阶段的罗非鱼肠道微生物丰度差异标记类群也存在一定差异，可能与鱼种来源、养殖环境及饲料有关。因此，生产中应结合实际情况，科学利用益生菌对罗非鱼肠道和养殖环境中微生态结构进行定向改良，切忌盲目使用益生菌。

关键词： 罗非鱼；肠道微生物；群落结构；多样性；高通量测序

中图分类号： S965.125 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1415-08

0 引言

【研究意义】鱼类肠道微生物存在于肠道壁、肠道黏膜及其内容物中（Cheesman and Guillemin，2007；Dethlefsen et al.，2007），是鱼类肠道的重要组成部分（宋增福和吴天星，2007；吕欣荣和肖克宇，2008），在维持机体代谢、发育及进化等方面发挥重要作用（赵明晓和贺永亮，2008；Bosch and McFall-Ngai，2011；Goodman and Gordon，2010）。鱼类肠道微生物处于特殊的肠道环境和水体环境中，极易受食物和环境等因素变化的影响，鱼体自身的生长也会影响其肠道微生物的群落结构（Spanggaard et al.，2000；Savas et al.，2005）。因此，研究分析鱼类肠道微生物的多样性，对筛选益生菌或调控其养殖环境等具有重要意义。【前人研究进展】目前，研究鱼类肠道微生物群落的传统方法是将微生物纯化后再进行培养（覃映雪等，2007；胡秀彩等，2010），该方法可对肠道微生物的形态、性质及其群落结构等进行常规分析，但在菌落形态和颜色变化等方面易存在主观性判断（Maidie et al.，2003）。此外，有学者运用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术绘制出草鱼肠道菌群的指纹图谱（郁二蒙等，2012），虽然该技术可较全面系统分析肠道菌群的生物多样性，但在时效上仍不及高通量测序技术（秦楠等，2011）。随着分子生物学的快速发展，基于PCR的分子生物学方法越来越多被应用于肠道微生物研究（周孟姣和刘臻，2003；赵翔和安志东，2003；凌云等，2010），极大提高了研究效率及分析的准确性，为肠道微生物研究奠定了良好基础（李凤和刘世贵，2003；任南琪等，2007）。其中，高通量测序技术是目前基因组学研究中应用最广泛的测序技术，具有通量更高、运行时间更短、测序片段更长、成本更低等优点（孙嘉蔓等，2014；叶雷等，2016），能有效避免Sanger法的繁琐克隆过程。王绍祥等（2014）通过高通量测序技术研究了鱼类养殖环境的微生物群落特征；许燕等（2018）采用Illumina HiSeq PE250高通量测序技术研究了斑石鲷肠道的细菌多样性和群落结構。【本研究切入点】目前，采用高通量测序技术分析养殖罗非鱼肠道微生物群落结构多样性的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】基于细菌16S rDNA高通量测序技术对海南省不同养殖地区整个养殖周期的罗非鱼肠道微生物多样性进行全面系统研究，为科学利用益生菌对罗非鱼肠道和养殖环境中微生态结构进行定向改良提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

分别于罗非鱼养殖周期的前期（C1，4月）、中期（C2，6月）和后期（C3，8月）对海南三江（SJ）、文昌（WC）和屯昌（TC）的罗非鱼养殖场进行定点样品采集，每个地点采集三口池塘作为生物学重复，样品编号及其具体信息见表1。

1. 2 DNA提取及16S rDNA高通量测序

采用Sigma公司生产的Stool DNA Kit试剂盒提取罗非鱼肠道内容物总细菌DNA，并以1%琼脂糖凝胶电泳和PCR进行检测。提取的DNA样品送至广州基迪奥生物科技有限公司进行16S rDNA高通量测序，测序区域为V3～V4区，测序平台为Illumina Miseq 2×250。

1. 3 测序结果分析

样品PCR扩增产物测序后拼接成Tag，并根据Tag进行物种分类、OTU分析、多样性分析和多样品的比较分析等。利用Mothur对测序序列进行去冗余处理，使用基于Naive Bayesian的分类器RDP Classifier工具对Tag进行物种注释。计算97%相似度下的OTU数量，并根据众数原则对OTU进行物种注释。采用PICRUSt进行OTU pathway注释，以Mothur进行样品α多样性分析；采用R软件进行热图分析、PCA分析、β多样性分析和样品聚类分析；并以LEfSe分析组间菌群差异。

2 结果与分析

2. 1 不同养殖阶段罗非鱼肠道微生物的α多样性差异分析结果

样品测序结果经去冗余处理后，各样品中Tag数量在24267～87672条，平均为60694条，测序长度301～489 bp，平均为440 bp；OTU Shannon稀释曲线趋于平緩并达到平台期（图1），说明测序量趋于饱和，高通量测序结果可较全面反映样品中微生物组成。利用Mothur计算0.03距离下的OTU数量，再基于OTU计算样品的α多样性，结果（表2）表明，平均OTU数量排序为C2期（9376.125）>C3期（8591.375）>C1期（6567.667）；此外，C2期的Shannon和npShannon指数均高于C3期和C1期，但Simpson指数最小，说明C2期罗非鱼肠道中的微生物物种丰度最高，即罗非鱼肠道微生物的多样性排序为C2期>C3期>C1期。

2. 2 不同养殖阶段罗非鱼肠道微生物物种组成差异分析结果

各养殖阶段罗非鱼肠道微生物种群数量占2.00%以上的有11个门，厚壁菌门（Firmicutes）为C1期和C2期的优势菌群，蓝细菌门（Cyanobacteria）为C3期的优势菌群（表3），其中厚壁菌门随养殖周期的推移而逐渐减少，表现为C1期（37.13%）>C2期（33.11%）>C3期（17.33%）；变形菌门（Proteobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、TM7和TM6随养殖周期的推移呈先增后降的变化趋势；放线菌门（Actinobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和梭杆菌门（Fusobacteria）则随养殖周期的推移呈不断增加趋势（图2）。

各养殖阶段罗非鱼肠道微生物种群数量占2.00%以上的属有14个，分别是分枝杆菌属（Mycobacterium）、暖绳菌属（Caldilinea）、聚球藻属（Synechococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）、环丝菌属（Brochothrix）、乳球菌属（Lactococcus）、梭菌属（Clostridium）、Cetobacterium、甲基弯曲菌属（Methylosinus）、邻单胞菌属（Plesiomonas）、Methylocaldum、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）（表4）。C1期的优势菌是乳球菌属（14.96%），其次为梭菌属（4.96%）和聚球藻属（5.11%）；C2期的优势菌是乳球菌属（12.68%），其次为假单胞菌属（4.40%）和芽孢杆菌属（3.73%）；C3期的优势菌也是聚球藻属（4.49%），其次为乳球菌属（4.15%）和芽孢杆菌属（3.27%）。由图3可看出，随养殖周期的推移，乳球菌属所占比例逐渐下降，芽孢杆菌属、假单胞菌属和分支杆菌属则呈先增后减的变化趋势。

从属水平上的物种表达谱热图（图4）可看出，养殖罗非鱼肠道微生物主要聚为两大分支，多数C1期和C3期聚为一支，多数C2期聚为一支，说明不同养殖阶段的罗非鱼肠道微生物组成差异明显。从图4还可看出，链球菌属（Streptococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、拟杆菌属（Bacteroides）、栖水菌属（Enhydrobacter）、肉食杆菌属（Carnobacterium）、乳球菌属、詹森菌属（Janthinobacteriu）、环丝菌属、嗜冷杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属（Flavobacterium）、葡糖醋杆菌属（Gluconobacter）、耶尔森菌属（Yersi-nia）、不动杆菌属（Acinetobacter）、沙雷氏菌属（Srratia）等细菌在C2期中的丰度明显高于C1期和C3期，其中多个属为条件致病菌，说明C2期致病微生物的含量较高。

2. 3 不同养殖阶段罗非鱼肠道微生物的菌群丰度差异分析结果

通过LEfSe分析组间菌群差异，可找出各组间特异的主要菌群。从图5可看出，海南三江养殖罗非鱼肠道在C1期的标志（与其他两个阶段丰度差异显著）微生物为暖绳菌目的暖绳菌科，C2期的标志微生物主要有链球菌科、明串珠菌科、肠球菌科、肉杆菌科、气球菌科、鞘脂杆菌科和拟杆菌科，C3期的标志微生物是芽孢杆菌科和巴斯德氏菌科。海南屯昌养殖罗非鱼肠道在C1期的标志微生物为肉杆菌科和栖水菌属，C2期的标志微生物主要有芽孢杆菌科、动性球菌科和巴斯德氏菌科，C3期的标志微生物主要为节杆菌属和微球菌科。海南文昌养殖罗非鱼肠道在C1期的标志微生物为栖水菌属，C2期的标志微生物主要为芽孢杆菌科和Pseudologum，C3期的标志微生物主要是伯克氏菌属和普氏菌属。可见，不同地区相同养殖阶段的罗非鱼肠道微生物丰度差异标记类群存在一定差异，可能与鱼种来源、养殖环境及饲料有关，但也存在相似之处，如养殖前期以栖水菌属最具代表性，中期主要以芽孢杆菌科丰度最高。

3 讨论

目前，有关罗非鱼肠道微生物的研究多集中在不同营养元素、药物或益生菌等添加对其多样性的影响（徐勇等，2007；刘小玲等，2013），而针对不同环境或不同养殖阶段的罗非鱼肠道微生物多样性研究较少。罗非鱼养殖过程中存在的最突出问题是病害频繁发生后导致抗生素滥用，因此如何运用生态、健康的方式进行病害防治已成为当前水产养殖的研究热点，其中益生菌在防治罗非鱼病害方面表现出成本低、无药物残留及生态友好等明显优势（赵光军，2014；刘海天等，2016）。本研究全面系统分析了不同养殖区域内各养殖阶段罗非鱼肠道微生物的变化情况，发现罗非鱼肠道微生物的物种丰度排序为养殖中期>养殖后期>养殖前期，其中α多样性分析结果显示，厚壁菌门和蓝菌门占据优势地位，与淡水鱼类肠道菌群的研究结果（Wu et al.，2010，2012）基本一致，说明厚壁菌门和蓝菌门是鱼类肠道的固有细菌门类，但其在不同鱼类肠道中所发挥的作用有待进一步证实。

鱼类肠道微生物的数量、群落结构与环境、饵料和发育等因素密切相关，具体表现为养殖水体中的微生物、盐度、水温，鱼类摄食的饵料、药物及其生理状态和发育阶段对鱼类消化道菌群结构均有影响（陈孝煊等，2005）。本研究结果也显示，不同养殖阶段的罗非鱼肠道微生物组成差异明显，且不同地区相同养殖阶段的罗非鱼肠道微生物豐度差异标记类群也存在一定差异，可能与鱼种来源、养殖环境及饲料有关，但也存在相似之处，如养殖前期以栖水菌属最具代表性，中期主要以芽孢杆菌科丰度最高。该结论可为罗非鱼肠道益生菌的筛选提供科学依据，并指导罗非鱼养殖生产过程中微生物制剂的科学使用，减少药残对生态环境的污染，进而改善罗非鱼的生长性能及其品质等。可见，罗非鱼肠道微生物资源丰富，具有极大的开发前景。

在研究方法上，汪立平等（2009）曾以不同方法提取罗非鱼幼鱼肠道微生物基因组DNA，再通过DGGE指纹图谱初步分析微生物多样性，但DGGE技术在灵敏度方面不及高通量测序技术，只能检测出含量在0.50%以上的菌种，且对实验者的操作熟练度要求较高。本研究基于细菌16S rDNA高通量测序技术对海南省不同养殖地区整个养殖周期的罗非鱼肠道微生物多样性进行分析，并证实采用高通量测序技术能检测到含量在0.03%以下的菌种，其灵敏度远高于DGGE技术，故建议今后开展微生物多样性分析时应首选高通量测序技术。

4 结论

不同养殖阶段的罗非鱼肠道微生物组成差异明显，且不同地区相同养殖阶段的罗非鱼肠道微生物丰度差异标记类群也存在一定差异，可能与鱼种来源、养殖环境及饲料有关。因此，生产中应结合实际情况，科学利用益生菌对罗非鱼肠道和养殖环境中微生态结构进行定向改良，切忌盲目使用益生菌。

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（責任编辑 兰宗宝）