邓崇文 陈艳辉 张志伟

[摘要]目的：探讨环状RNA circEPSTIl对人胃癌SGC-7901细胞的生物学功能。方法：运用MTT实验检测circEPSTIl对人胃癌SGC-7901细胞的生长能力；AnnexinV-FITC/PI检测circEPSTIl对人胃癌SGC-7901细胞的凋亡作用。结果：MTT检测发现，敲低circEPSTIl可抑制人胃癌SGC-7901细胞的生长，具有时间依赖性；AnnexinV-FITC/PI实验显示，敲低circEPSTIl能显著促进胃癌SGC-7901细胞的凋亡作用，差异有统计学意义（P<0.05），结论：敲低circEPSTIl可抑制人胃癌细胞生长，诱导胃癌细胞凋亡

[关键词]circEPSTIl；胃癌；生長与凋亡

非编码RNA的种类繁多，其中包括了具有调节功能的微小RNA（microRNAs， miRNAs）以及环状RNA（ circular RNAs，circRNAs）等。miRNA是一类广泛存在于真核牛物中的长度约22nt的内源性单链非编码RNA分子[1]。miRNA的主要作用机制是与靶基因的3' UTR形成不完全互补配对，阻断靶基因翻译从而达到基因调控的目的。或与靶基因形成完全互补配对，引起靶基因在互补区发牛断裂，导致基因沉默[2]。circRNA是南外显子和（或）内含子转录物构成的共价环状闭合的单链RNA，其广泛存在于各种细胞中，有着比线性RNA更为稳定的特性[3]。然而目前关于circEPSTIl在胃癌中的表达情况、牛物学功能以及参与胃癌发牛发展的作用机制仍不清楚。本研究采用MTT、细胞流式检测分析circEPSTIl在人胃癌SGC-7901细胞中的牛物学行为，为进一步阐明胃癌发牛发展的分子机制提供实验依据。

1 实验方法

1.1 体外细胞培养常规培养。

1.2 MTT测定以每孔5000个细胞的密度接种在96孔板中，并在370C孵育24小时。然后将细胞再培养48小时，并且根据说明书进行MTT测定。使用Bio-Tek EPOCH2测量570nm的吸光度；

1.3 si-RNA转染目的细胞完全培养基中细胞生长至约50%密度；计算配好lipofectamin2000及转染；室温下放置20 min，使DNA与脂质体形成复合体；用无血清培养液洗涤培养瓶中的细胞。往复合体中加入无血清的培养液（不含抗牛素），温和混匀，加入到待转染的培养瓶中；置于37。C，5%C02培养箱中，放置24-48 h后，收集细胞，进行实验。

1.4 Annexin V/PI双染色法细胞凋亡实验 （1）用去离子水将10×Binding Buffer稀释成1×缓冲液；（2）细胞收集。用不含EDTA的胰酶消化收集后，于室温2000rpm离心5～10分钟，收集细胞；（3）细胞洗涤：用预冷1×PBS（ 40C）重悬细胞一次，2000rpm离心5～10分钟，洗涤细胞；（4）加入300卜L1的1×缓冲液悬浮细胞；（5）Annexin V-FITC标记：加入5μ1的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15分钟；PI标记：上机前5分钟再加入5μ1的PI染色；（6）补加200卜Ll的1×缓冲液；（7）流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检测PI；（8）结果判读：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（ FITC-IPI-）；有上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（ FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-），

1.5 统计学处理采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。所有结果均以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，当P<0.05时，为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT检测circEPSTIl对人胃癌SGC-7901细胞生长的影响通过转染circEPSTIl的siRNA及其对照过夜后，消化细胞，将人胃癌SGC-7901细胞以2×103个的密度接种于96孔板，每种细胞接种4孔，连续3天在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值，记录结果取均值并绘图，实验重复3次。结果表明，在转染circEPSTIl siRNA 24h、48h、72h后OD值为（0.484±0.003）、（0.575±0.003）、（0.654±0.003）分别与对照组（0.563±0.037）、（0.759±0.028）、（0.955±0.031）比较，差异均有统计学意义（P<0.05），提示过表达circEPSTIl可抑制人胃癌SGC-7901细胞的生长。

2.2 敲低circEPSTIl诱导胃癌细胞的凋亡为检测敲低circEPSTIl对胃癌细胞的抑制效果，我们选用SGC-7901胃癌细胞，circEPSTIl处理48 h后，选用AnnexinV-FITC和PI染色来检测凋亡细胞，结果显示，circEPSTI1可以引起的细胞凋亡（21.67±1.49）%，而经sl-control处理的阴性对照组（7.50±0.87）%，无明显的细胞凋亡发生。该结果说明敲低circEPSTIl可诱导胃癌细胞SGC-7901发生凋亡。

3 讨论

近几年随着牛物信息学以及高通量测序技术的进步，环状RNA的研究得到了前所未有的关注与发展。迄今为止，科学家们已经在各种生物体中发现了超过一万种不同的环状RNA。由于环状RNA具有独特的结构，细胞类型特异性和组织特异性表达模式，以及在血液，唾液和外泌体中稳定表达的特点，环状RNA成为了当今癌症研究中的热点。关于clrcRNA在胃癌中的作用知之甚少，circRNA 000479来自EPST11基因，其位于染色体13q14上，因此我们将circRNA 000479命名为“circEPSTIl”。EPSTI1基因功能涉及广泛的上皮一基质相互作用[2]，先天性免疫[2]，并且该基因的表达可能是癌症侵袭和转移中的关键事件[1]。携带EPSTI1和circEPSTIl的染色体13q14的异常常见于包括胃癌在内的多种癌症[3-5]。本研究通过MTT以及细胞凋亡实验证实敲低circEPSTIl能够抑制胃癌细胞系的生长与增殖，并且促进凋亡。这些结果说明circEPSTIl能够促进胃癌的恶性生物学行为，有可能成为潜在的治疗靶点。

综上所述，我们的研究表明环状RNA在胃癌恶性生物学行为中发挥作用，可能通过作为miRNA海绵发挥调节功能。下一步通过体内体外的功能实验，阐明circEPSTIl通过涉及竞争性内源RNA的机制影响胃癌的增殖和凋亡的分子机制。对环状RNA的进一步研究和关注将有助于我们更好地了解胃癌的进展，并为胃癌的生物标志物或潜在治疗靶点提供新的思路。

参考文献

[l]Chen LL.The biogenesis and emerging roles of circular RNAs.Nature reviews Molecular cell biology.2016；17：205-11

[2]Sanger HL，Klotz qRiesner D.Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.Ptoceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.l976；73：3852-6

[3lSalzman J，Gawad C，Wang PL.Circular RNAs are the predominant transcript isofonn from hundreds of human genes in diverse cell types.PloS one.2012；7：e30733.

[4]Jeck WR，Sharpless NE.Detecting and characterizing circular RNAs.Nature biotechnology.2014；32：453-61.

[5]Jeck WR，Sorrentino JA，Wang K.Circular RNAs are abundant，conserved，and associated with ALU repeats.Rna.2013；19：141-57