丁佳荣，张 岚，郭红樱，张遐耘，陈 宸

(1． 上海市历史博物馆，上海 200003； 2． 浙江省微生物研究所，浙江杭州 310012)

0 引 言

霉菌的生长是木质文物腐烂的主要原因，因此防霉是博物馆文物保护工作中的重要内容之一[1，2]。志丹苑元代水闸遗址发现于2001年5月，遗址内有大量木构件，由于长时间处于潮湿状况，防霉工作极为重要。自2002年5月正式发掘来，共开展了三次微生物菌群调查，分别在2002、2006、2012。2007年起选择了防霉剂IPBC(碘代丙炔基氨基甲酸酯Iodopropy-nyl Butyl Carbamate)处理木材。至今遗址木构件一直采用该防霉剂，以1份原液兑20份水的浓度配比(约5%)，解决侵蚀木构件的霉腐问题。该方法是经过抑菌验证，证明对当时的微生物生长具有明显的抑制作用。但是，随着时间的推移，木构件中的菌群对防霉剂会产生耐药性。遗址木质文物从初期每两个月用防霉剂喷涂一次，到目前不到一个月就要再次喷药。为此2015年9月再次对遗址内的空气及木构件的霉菌进行了种类调查。从木构件上分离到8株高丰度霉菌，用IPBC对分离到的菌种进行了实验室抑菌效果评价，为下一步筛选更有效的防霉剂奠定了基础。

1 材料与方法

1．1 培养基及试剂

1．1．1分离培养基(PDA) 马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂15g；氨苄青霉素100mg；蒸馏水1L；pH=6．0。

1．1．2鉴定培养基(查氏) 硝酸钠3g；磷酸氢二钾1g；硫酸镁0．5g；氯化钾0．5g；硫酸亚铁0．01g；蔗糖30g；琼脂20g；蒸馏水1000mL。

1．1．3提取试剂盒 Qiagen 69504；PCR试剂：PCR Amplification Reagents。

1．1．4防霉剂 碘代丙炔基氨基甲酸酯，三博生化科技(上海)有限公司生产。

1．2 设备

医用净化工作台YJ-1300A净化等级100级；生化培养箱LRH-250A(15～40)±1．0℃；ABI 3730XL测序仪。

1．3 采样

1．3．1木构件文物霉菌采样点 采样点共计13处，分别为M1-1、M1-2、M2-1、M2-2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11。

1．3．2采样方法 选择木构件长霉部位，用无菌手术刀将表层腐木除去，取内层部分3～5g装入灭菌袋中。

1．4 试验方法

1．4．1木构件文物霉菌分离 在无菌条件下，13处木构件样品用稀释法分别进行微生物培养，分离。

1．4．2木构件文物霉菌鉴定[3-5]

1) 形态观察。菌落形态观察包括菌落大小、菌落正反面颜色、菌落质地等；

2) 显微观察：显微观察菌丝和孢子形态特征；

3) DNA-ITS序列分析[6]。

收集菌体用液氮，研磨破壁。使用Qiagen 69504试剂盒提取DNA，引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反应体系见表1，PCR反应条件见表2。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应条件

注： ①ITS引物的退火温度为55℃，V4区退火温度为51℃。

将合格PCR产物扩增产物与T载体连接后送测序公司测序，获得的ITS序列上机进行测序，所得结果在NCBI(http：//www.ncbi.nlm．nih．gov/)网站上进行比对。同源性比较，并结合形态特征，对样品系进行分类鉴定。

1．4．3IPBC抑霉试验 试验以滤纸片法进行。把供试菌制成105浓度的孢子悬浮液，取1mL菌悬液至9cm直径的培养皿中，倒入约15mL已灭菌的培养基，与菌液混匀，制成平板。然后，将吸附了20μL的5%IPBC的，直径8mm的滤纸片贴于带菌琼脂平板正中。27℃恒温恒湿培养箱中培养14d。用游标卡尺测量抑菌圈直径。每种防霉灭菌剂做3个平行。

2 结果与分析

2．1 分离、鉴定结果

2007至今遗址木构件一直使用IPBC防霉剂。经过这么多年的驯化，木构件中大多是耐药性的菌群，同时随着木构件成分的变化，木构件中的菌群结构也会跟着发生改变(不同的微生物专注于不同的营养成分)。本次从木构件样品中分离到8类霉菌。按照《真菌鉴定手册》的方法进行了菌种的鉴定，分别是：1)盘菌科菌下未分类菌(Pezizaceaeunclassified)；2)高大毛霉(MucorMucedo)；3)绿色木霉(Trichodermaviride)4)镰刀霉(Fusariumkeratoplasticum)5)枝顶孢霉(Monacrosporiumsp．)；6)裴氏着色真菌(Fonsecaeapedrosoi)；7)黄绿青霉(Penicilliumcitreo-virde)；8)黄柄曲霉(Aspergillusniger)。

2．2 遗址木构件各霉菌在木构件样品中的分布

不同部位的木构件上所长的霉菌是不一样的，对13个样品逐一进行的霉菌的筛查分析结果见表3。

表3 不同霉菌在不同木构件样品中的分布

从表3可看出绿色木霉在13个样品中出现9次，是分布最广的一种霉菌。其次是盘菌科菌和镰刀霉。

2．3 IPBC对试验霉菌的抑制作用

遗址实际使用IPBC浓度对遗址木构件样品中分到的8类霉菌进行抑制试验，结果见表4。

5%IPBC浓度对遗址木构件样品中分到的8类霉菌进行抑制试验所得抑菌圈见图1。

表4 IPBC对试验霉菌的抑制作用

图1 5%的IPBC对8株试验菌第14d的抑菌圈Fig.1 Inhibition zone of 5% IPBC on 8 test molds on the 14th day

5%的IPBC浓度对分离到的木构件霉菌绿色木霉、盘菌科菌、镰刀霉、枝顶孢霉、裴氏着色真菌、高大毛霉、黄绿青霉、黄柄曲霉进行抑菌试验。结果显示IPBC对绿色木霉、盘菌科菌、黄柄曲霉的抑制作用较强，而对枝顶孢霉、高大毛霉、镰刀霉抑制作用较差，特别对镰刀霉作用最弱。

3 讨 论

干湿交替是防霉大忌。遗址内的木构件为了保湿，防干裂，要阶段性喷水，增加了防霉工作的难度。遗址于2007年、2012年均对IPBC处理前后木桩群进行过霉菌类型鉴定，结果如表5。对比2．1的结果分析可知，木桩本次分离到多种前两次未分离到过的霉菌类型，包括分布最广的绿色木霉和盘菌科下未分类的一株菌。这些霉菌里要特别引起注意的是绿色木霉，它以产纤维素酶高而著名。自然界腐烂的植物上常能见到，它的大量出现势必会加快木构件的降解。筛选高效抑制绿色木霉的防霉剂势在必行。

表5 IPBC处理前后木桩群侵蚀微生物种类变化

IPBC是优异的防霉剂，高效环保，是本遗址常用防霉剂。用IPBC对分离到的霉菌进行单菌抑菌试验发现，其对绿色木霉和盘菌的抗性较强，但是这两个菌还是在遗址木构件中广泛存在。造成这样结果的原因是木构件不间断喷水防裂使药物流失，药效不能很好地发挥。因此，药物的抗流失性和施用方法也是今后值得研究的方向。

4 结 论

本次工作探明了遗址木桩上主要危害菌的丰度及种类，这为有针对性筛选防霉剂及使用浓度和使用期限奠定了良好的物质基础。目前，正在利用分离到这8种霉菌为试验指示菌，有针对性地筛选抑制遗址木材特定霉菌的防霉剂，特别是抑制绿色木霉和盘菌，包括对IPBC的改良。已找到与对照防霉剂IPBC比更广谱，抑菌效果明显，持久性提高的药物。实地试验正在进行中，相关试验结果将陆续发表。