马菁雯,赵 艳

(上海市宝山区中西医结合医院,上海 201900)

宫颈癌是影响女性健康和生命安全最常见的生殖系统恶性肿瘤之一，其病理过程涉及多基因改变和多发生步骤。拓扑异构酶ⅡA(TOP2A)的表达在血管生成、骨髓造血、能量代谢和肿瘤的发生进展过程中具有重要意义[1]。血管内皮生长因子(VEGF)是刺激肿瘤血管生成最主要的细胞因子之一[2]，可促使宫颈鳞状细胞癌(CSCC)的快速生长[3]。本研究探索了TOP2A和VEGF在CSCC中的表达情况和临床意义，现报道如下。

1 临床资料

1.1一般资料 收集2015年2月—2016年6月我院妇产科64例CSCC组织标本，并经术后病理证实。患者年龄38～70(51.3±9.2)岁，国际妇产科学联盟FIGO(2009)分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期患者分别为30例、24例和10例。收集22例同时间段在我院妇产门诊行宫颈活检者正常宫颈组织标本，且经病理证实，受检者年龄32～66(48.2±8.7)岁。所有患者未行术前化疗和放疗，无其他肿瘤病史。患者均签署知情同意书。该研究通过我院伦理委员会批准。

1.2方法 分别采用实时定量PCR法和免疫组化方法检测各标本中TOP2A、VEGF mRNA和蛋白表达情况并进行分析。

1.2.1实时定量PCR 采用TRIzol试剂盒(Invitrogen)提取组织RNA，M-MLV逆转录酶(Promega)合成cDNA，ABI Prism 7500序列检测系统(Applied Biosystems)进行RT-PCR。以β-actin分别作为TOP2A和VEGF PCR标准参照。TOP2A、VEGF、β-actin的反转录引物和PCR引物购自广州Thermo Fisher公司。TOP2A和VEGF相对表达量均采用2(-ΔΔCq)方法检测。所有实验独立重复3次。正反向引物序列如下：TOP2A，5’-CATGCGCTAGACTCCGAGAACA-3’和5’-GCTTTGCGAGCATCCGGTA-3’；VEGF，5’-GAGCCTTGCCTTGCTGCTCTA-3’和5’-CACCAGGGTCTCGATTGGATG-3’；β-actin，5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’和5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。

1.2.2免疫组化 4%多聚甲醛固定标本后行石蜡包埋并切片，采用Histostain-Plus试剂盒(Invitrogen)进行免疫组化染色，2位独立双盲的病理医生进行显微镜下染色结果评估。染色阳性的棕黄色颗粒主要定位于胞浆内，少部分分布于细胞核或细胞膜上。结果判读：TOP2A和VEGF的阳性信号均主要定位于胞浆内的棕黄色颗粒，少部分定位于细胞核或细胞膜上；TOP2A和VEGF阳性细胞数<5%为“-”，5%～25%为“+”，>25%～50%为“”，>50%为“”，本研究中“-”和“+”属于低表达，“”属于中表达，“”属于高表达。

2 结 果

2.1不同宫颈组织中TOP2A和VEGF mRNA表达情况和相关性 实时定量PCR结果显示，CSCC组织中TOP2A和VEGF mRNA表达水平明显高于正常宫颈组织中表达水平(P均<0.05)，见表1。Pearson相关性检验发现TOP2A和VEGF mRNA表达具有显著相关性(r=0.778,P<0.001)，见图1。

表1 CSCC组织和正常宫颈组织中TOP2A和VEGF mRNA表达水平

图1 CSCC组织中TOP2A和VEGF mRNA表达Pearson相关性分析

2.2CSCC组织中TOP2A和VEGF mRNA的表达和临床参数的相关性 CSCC组织中TOP2A和VEGF mRNA的表达与患者年龄无明显相关性(P均>0.05)，与FIGO分期和淋巴结转移呈正相关(P均<0.05)。见表2。

2.3不同宫颈组织中TOP2A和VEGF蛋白表达情况及其相关性 免疫组化结果显示，染色阳性的棕黄色颗粒主要定位于胞浆内，少部分分布于细胞核和细胞膜上，见图2～11。CSCC组织中TOP2A和VEGF蛋白表达阳性率明显高于正常宫颈组织中蛋白表达阳性率(P均<0.05)。见表3。

表2 CSCC组织中TOP2A和VEGF mRNA表达与临床参数关系

注：①与Ⅰ期比较，P<0.05；②与阳性比较，P<0.05。

图2 TOP2A蛋白在正常宫颈组织中表达情况(×200)

图3 TOP2A蛋白在CSCC组织中低表达(×200)

图4 TOP2A蛋白在CSCC组织中中表达(×200)

图5 TOP2A蛋白在CSCC组织中高表达(×200)

图6 TOP2A阴性对照(×200)

图7 VEGF蛋白在正常宫颈组织中表达情况(×200)

图8 VEGF蛋白在CSCC组织中低表达(×200)

图9 VEGF蛋白在CSCC组织中中表达(×200)

图10 VEGF蛋白在CSCC组织中高表达(×200)

图11 VEGF阴性对照(×200)

项目n免疫组化结果/例-+ 阳性/例(%)TOP2ACSCC组织正常宫颈组织642241822414024060(93.8)①4(18.2)VEGFCSCC组织正常宫颈组织642261812416030058(90.6)①4(18.2)

注：①与正常宫颈组织相比，P<0.05。

2.4随访结果 本研究患者随访12个月。免疫组化结果中，TOP2A蛋白低表达(-和+)共26例，其中5例死亡，21例存活；TOP2A蛋白中表达()共14例，其中4例死亡，10例存活；TOP2A蛋白高表达()共24例，其中8例死亡，16例存活。而VEGF蛋白低表达(-和+)共18例，其中4例死亡，14例存活；VEGF蛋白中表达()共16例，其中4例死亡，12例存活；VEGF蛋白高表达()共30例，其中9例死亡，21例存活。基于上述研究结果绘制Kaplan-Meier生存曲线，表明TOP2A和VEGF蛋白高表达的患者生存率明显低于阴性表达和低表达的患者，见图12及图13。

图12 TOP2A蛋白不同表达水平的生存率

2.5CSCC组织中TOP2A和VEGF蛋白表达相关性 TOP2A蛋白阳性表达和VEGF蛋白阳性表达之间存在正相关关系(P<0.05)。见表4。

3 讨 论

图13 VEGF蛋白不同表达水平的生存率

TOP是低氧耐受过程中最重要的异源二聚体分子，由α和β亚基构成。α亚基对氧浓度高度敏感，是TOP分子的功能基团和活化基团[4]，而β亚基不受氧浓度的调节，是TOP分子的机构基团。目前已知已分离鉴定出的α亚基包括1α、2α、3α，它们都可与β亚基结合组成二聚体，进而分别组装成TOP1A、TOP2A和TOP3A。在缺氧条件下，TOP2A蛋白表达受氧依赖性降解域(ODD)调控[5]。然而，在正常氧浓度条件下，TOP2A蛋白易受泛素-蛋白酶体作用而降解。因此，TOP2A在正常机体的组织和细胞内的表达处于低水平状态。当细胞内氧浓度下降时，TOP2A的降解过程受到抑制，胞浆内TOP2A表达增多[6]，并相继转移至胞核内，通过与TOP2A受体结合，启动靶基因特异序列转录表达[7]，发挥其多种生物学功能。在缺氧条件下，TOP家族可调节多种基因的表达[8]，参与肿瘤细胞的增殖、分化、代谢、转移和血管生成[9-10]。因此，TOP2A可能在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移中起着促进作用。

已有研究表明，在正常组织和器官中，TOP2A蛋白呈低表达状态，但是在肿瘤细胞如子宫内膜癌、膀胱癌、肾细胞癌、乳腺癌、肝癌和前列腺癌中TOP2A蛋白表达明显升高[11]。本研究结果显示，在CSCC组织中，TOP2A mRNA表达水平和TOP2A蛋白表达阳性率明显高于正常宫颈组织。这可能跟宫颈鳞状细胞癌恶性增殖的病理生理过程介导的缺氧机制有关[12-13]。有研究指出，TOP家族通过调控相关靶基因和参与细胞能量代谢介导肿瘤细胞缺氧耐受，从而促进靶基因蛋白如survivin表达，进而增强肿瘤细胞的侵袭能力[14]。在本研究中也发现，淋巴结转移阳性患者的CSCC组织中TOP2A mRNA表达水平明显高于阴性患者。

VEGF是肿瘤细胞刺激血管生成的主要细胞因子之一，在细胞缺氧时其表达水平明显增加。因此，缺氧条件下血管内皮生长因子依赖性血管生成是肿瘤组织生成新生血管的关键步骤[15]。许多恶性肿瘤细胞都能具有自分泌VEGF的能力，合成的VEGF能够诱导血管生成，导致相应的结构和功能异常，从而加速肿瘤的发生和发展。同时，VEGF可增强血管内皮细胞的活性，促进细胞分裂，增加微血管的通透性，促进细胞迁移和抑制细胞凋亡[16]。研究发现，在宫颈癌患者血中VEGF水平显著增加，VEGF可明显促进宫颈鳞状细胞癌的血管生成[17]。本研究发现，在CSCC组织中，VEGF mRNA的表达水平和VEGF蛋白表达阳性率均明显高于正常宫颈组织，同其他研究结果一致。

既往研究发现，高表达的TOP2A可增加肿瘤细胞VEGF的合成[18]。本研究结果显示，在CSCC组织中TOP2A和VEGF mRNA的表达水平均明显高于正常宫颈组织，并且TOP2A的表达与VEGF的表达有显著正相关性。有研究发现，在CSCC组织中TOP2A呈高表达状态，并且与放疗敏感性密切相关[19]。本研究结果显示，在CSCC组织中，TOP2A和VEGF mRNA表达水平与患者年龄无明显相关性，而与FIGO分期和淋巴结转移有显著相关性。部分研究发现TOP2A可能在部分肿瘤具有特异性，例如TOP2A在小细胞肺癌(SCLC)患者体内呈低表达，且不影响肿瘤细胞的存活时间[20]；而非小细胞肺癌(NSCLC)患者高表达TOP2A，生存时间显著缩短，这表明TOP2A可能是一个独立的影响患者预后的指标[21]。TOP2A可结合VEGF基因启动子[18]，增加VEGF mRNA的表达。高表达的VEGF促进了血管内皮细胞的分裂、增殖和迁移，促进血管新生，从而在一定程度上改善肿瘤组织的缺氧状态。本研究结果显示，宫颈鳞状细胞癌组织中TOP2A和VEGF mRNA的高表达可能预示着宫颈癌淋巴结转移的高风险。通过绘制Kaplan-Meier生存曲线，笔者发现TOP2A和VEGF蛋白高表达的患者总体生存率明显差于阴性表达和低表达的患者，推测宫颈鳞状细胞癌患者的临床FIGO分期可能与生存率有一定相关性。

综上，高表达的TOP2A可能通过调节VEGF的表达，参与CSCC的发生、发展、侵袭和转移。而在正常的宫颈组织中，TOP2A和VEGF呈低表达状态。这为CSCC的预防和治疗提供了新的思路。