周竹君，高基民

(温州医科大学检验医学院 生命科学学院，浙江 温州 325035)

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，也是我国目前的第一大癌[1-3]，由于缺乏早期的诊断和系统的治疗方法，肺癌病人的预后很差。香烟烟雾中含有60多种致癌物，其中苯并芘(benzoapyrene，B[a]P)是重要的完全致肺癌多环芳烃类化合物[4-5]。苯并芘在环境中分布广泛，存在于煤炭、石油等矿石燃料不完全燃烧产生的烟气和香烟烟雾中。人类每天通过吸烟或者被污染的空气、食物和水等途径，摄入一定量的苯并芘，苯并芘通常在动物模型(如小鼠、大鼠和仓鼠)中诱发肺鳞状上皮细胞癌[6]。慢性炎症与肿瘤的发生发展密切相关，主要包括促进肿瘤恶性转变、肿瘤细胞的增殖与侵袭、肿瘤组织血管的生成[7]。近年来，关于肿瘤免疫方向的研究表明，在慢性炎症向癌症转变的过程中，免疫微环境发生了一系列的动态变化。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞会分泌和诱导机体产生许多免疫抑制性分子，促进免疫微环境向免疫抑制性方向发展。明确肺癌发生的分子机制，有望通过改善肺慢性炎症组织内免疫抑制微环境，为肺癌的早期预防和免疫治疗提供新的策略。体内动物模型的建立可以帮助研究者开展疾病相关病理机制和早期治疗靶点的研究，制备出能够体现人类吸烟引起的肺慢性炎症的病理特征的动物模型十分必要[8]。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级雄性昆明小鼠，购自上海动物实验中心，引进饲养在温州医科大学动物实验中心，6～8周龄，体重(60±5)g。

苯并芘购自中国阿达玛斯试剂有限公司；玉米油购自美国 Sigma 公司；FITC标记的CD3，APC标记的CD8抗体购自美国 BioLegend公司。

1.2 方法

将60只 SPF级昆明种小鼠，置于室温25 ℃，相对湿度55%，12 h明暗交替的环境中饲养，自由饮水。适应1周后，将小鼠随机分成2组，经右侧胸壁穿刺肺内注射，对照组给予50 μL玉米油，处理组给予50 μL苯并芘-玉米油溶液(苯并芘浓度为20 mg·mL-1),每周处理1次，共4次。每日观察小鼠饮食、排便、毛色、精神和活动状况。分别在处理后30、90、180 d处死小鼠，称重并采样以供检测。

1.3 样品测定

1.3.1 小鼠肺组织形态的观察

将小鼠肺组织取出，10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色，光镜下观察组织形态变化，比较炎症细胞浸润程度及肿瘤细胞浸润情况。

1.3.2 细胞毒性T淋巴细胞的浸润情况

将小鼠肺组织和脾脏取出，研磨消化制成单细胞悬液，200目尼龙膜过滤，Anti-CD3-FITC、Anti-CD8-APC流式抗体染色，4 ℃避光孵育30 min，IMDM培养基清洗3遍，上机分析。

1.4 数据分析

用Prism 5.0软件进行t检验，ns表示差异不显著(P>0.05)，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

2 结果与分析

2.1 小鼠肺组织形态

小鼠右侧肺组织切片见图1。如图所示，处理组小鼠肺组织出现了明显的炎症反应和病理改变，随着暴露时间的延长炎症反应和病理改变逐渐明显。苯并芘暴露180 d后，小鼠肺组织出现大量异型性细胞，肺组织的正常生理结构消失，出现肺癌特征。对照组小鼠肺泡腔、毛细血管及终末细支气管均无明显的结构异常。

2.2 小鼠脾脏质量的改变

不同处理对小鼠脾脏质量的影响见图2。如图所示，随着苯并芘暴露时间的延长，处理组小鼠脾脏出现明显肿大。

2.3 小鼠肺组织中CD8+T细胞的浸润情况

CD8+T细胞是由原始T细胞分化而来的一个亚群，是机体细胞免疫的重要效应分子。CD8+T细胞识别内源性抗原肽+MHC I类分子复合物，活化之后的效应分子具有强大的杀伤功能，能够分泌某些活化型细胞因子如IFN-γ、颗粒酶和穿孔素等来应答内源性抗原和杀伤肿瘤细胞。不同处理小鼠肺组织CD8+T细胞表达的代表性流式细胞图见图3。

a，玉米油暴露30 d；b，玉米油暴露90 d；c，玉米油暴露180 d；d，苯并芘暴露30 d；e，苯并芘暴露90 d；f，苯并芘暴露180 d

图2 不同处理对小鼠脾脏质量的影响

a，玉米油暴露30 d；b，玉米油暴露90 d；c，玉米油暴露180 d；d，苯并芘暴露30 d；e，苯并芘暴露90 d；f，苯并芘暴露180 d

不同处理对小鼠肺组织CD8+T细胞水平的影响见图4。小鼠在苯并芘暴露30 d和90 d时,肺组织CD8+T细胞处于上升的趋势，表明炎症反应明显。当苯并芘暴露180 d时，小鼠肺组织CD8+T细胞显著下降，表明小鼠体内的CD8+T细胞处于耗竭状态。

2.4 小鼠脾脏中CD8+T细胞的浸润情况

不同处理小鼠脾脏中CD8+T细胞表达的代表性流式细胞图见图5。不同处理对小鼠脾脏中CD8+T细胞水平的影响见图6。小鼠在苯并芘暴露90 d时,脾脏中CD8+T细胞显著增加。当苯并芘暴露180 d时，脾脏中的细胞毒性T淋巴细胞显著减少，处于耗竭状态。

图4 不同处理小鼠肺组织CD8+T细胞水平

a，玉米油暴露30 d；b，玉米油暴露90 d；c，玉米油暴露180 d；d，苯并芘暴露30 d；e，苯并芘暴露90 d；f，苯并芘暴露180 d

图6 不同处理小鼠脾脏中CD8+T细胞水平

3 讨论

目前，因环境污染及吸烟等因素导致肺癌的发病呈逐年上升的态势，依据世界卫生组织癌症研究中心(IARC)的调查报告，肺癌已经成为全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，每年因肺癌死亡的人数约140万。研究表明，肺癌与吸烟呈正相关，香烟烟雾中含有60余种致癌物，其中苯并芘(benzoapyrene，B[a]P)是最重要的完全致肺癌化合物[4-5]。苯并芘是多环芳烃类化合物的一种，具有较强的致癌作用，在环境中分布广泛，存在于煤炭、石油等矿石燃料不完全燃烧产生的烟气及其香烟烟雾等。苯并芘能通过多种途径诱导肺癌，常用小鼠来建立肺癌动物模型，便于直接观察肺慢性炎症至肺癌的动态演变过程以及肺癌发生发展过程的形态变化。

苯并芘易诱导动物模型(如小鼠，大鼠和仓鼠)发生肺鳞状上皮细胞癌[6-8]，这些肿瘤在形态学和分子生物学上与人类相似。在苯并芘给药后相对较短时间内， 随着时间的延长，小鼠自发长出大量的肿瘤并产生强烈的肺肿瘤反应[9-10]，且与人肺癌有许多相似的遗传、生物化学和组织病理学特征，因此小鼠已广泛用于苯并芘的致癌作用以及干预策略的效应研究[11]。值得一提的是，苯并芘诱导肺癌有多种途径，包括口服、皮下注射、气管内灌注、吸入、腹腔注射及胸腔穿刺给药等[12-16]，通过饮食中添加一定剂量的苯并芘可以诱导小鼠肺部肿瘤，但是苯并芘剂量受饮食量的影响，并且易诱发肝肿瘤和胃肿瘤。也有报道通过皮下注射和腹腔注射苯并芘的方法来诱导肺部肿瘤，但是会出现肿瘤的多样性，不仅小鼠肺部会出现肿瘤，而且局部注射位置以及小鼠肝脏、胃肠道、食管等也会出现肿瘤。雾化吸入的方法是最接近吸烟的动物模型，但是成瘤率低，并且会造成空气污染以及有损实验操作者的健康。通用的造模方法是气管内灌注，但是对操作者要求较高。综合考虑，采用经胸腔穿刺肺内直接注射法来构建小鼠肺癌模型，这种方法创伤小，不易造成气胸，小鼠恢复快，并且定位准确，用无致癌作用的玉米油作为溶介可防止挥发。

昆明小鼠肿瘤自发率低，抗病力和适应力很强，繁殖率、成活率高，并且价格便宜。采用昆明小鼠作为实验小鼠，经胸腔穿刺肺内直接注射苯并芘来构建昆明小鼠肺癌模型，为后续研究吸烟及烟雾诱导的肺癌发生的分子机制提供了良好的模型基础。