周会明，张焱珍，柴红梅，孔令舰，刘芳艳，陆艺娇，雷启丽，黄 雯

(1.滇西科技师范学院 生物技术与工程学院，云南 临沧 677000； 2.云南省农业科学院 生物技术与种质资源研究所，云南 昆明 650221)

鸡瑽菌(Termitomyces)隶属于真菌界、担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口蘑科，是一类具有较高营养价值和药用价值且极为稀少的野生食用菌[1-2]。国内外关于鸡瑽菌的研究已长达200多年[3]，主要集中于营养分析[4]、液体发酵[5]、产品贮藏[6]、产品工艺[7]、活性成分测定[8]、与白蚁的共生关系[9-12]等方面，而针对鸡瑽菌的遗传多样性分析较少[13]。

在《菌物索引》收录的69个鸡瑽菌名称中，我国有24个种类，其中，四川有9种，贵州有8种，广东有4种，其他省区仅有1～2种，云南达20种[14-15]。鸡瑽菌是云南省临沧市野生菌主打产品，但随着市场需求日益增加，当地自然生态系统的严重破坏，以及过度采摘，导致该菌的野生资源遭到了严重破坏，因此，针对鸡瑽菌进行遗传多样性研究在资源保护与可持续利用方面具有重要的意义[13]。除了鸡瑽菌形态特征分析，在近缘种分析方面，真菌核糖体DNA序列系统分析被较多的研究者采用[16-17]，对最适培养基的筛选又可了解鸡瑽菌的生长发育特点，为其人工保育打下基础。

本研究以临沧市各地搜集的鸡瑽菌为材料，借助rDNA内转录间隔区(ITS)分子标记技术，明确当地的鸡瑽菌类别，并从营养学的角度初步筛选最适菌株及其培养基，为该菌种的资源保护和开发提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

从临沧市各地采集13个鸡瑽菌菌株(表1)样品，经组织分离得到纯化菌株，作为本试验供试材料。ITS序列系统分析共采用38个序列片段，其中25个来自于GenBank。

1.2 菌株培养及DNA提取

接种少量菌丝体到5mL YPD(0.2%蛋白胨、0.2%酵母粉、2%葡萄糖、1.5%琼脂粉，pH值自然)液体培养基中，25 ℃恒温培养2周。取菌丝体置于2 mL离心管中，液氮冷冻条件下研磨至粉末状，使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法抽提DNA，然后用0.8%琼脂糖检测DNA的质量和浓度[18]。

1.3 PCR扩增及序列测定

以引物NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和NS4(5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′)扩增18S nrDNA片段，以引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)扩增ITS片段。50 μL反应体系包括：2×PowerTaqPCR MasterMix 25 μL(北京百泰克生物技术有限公司)、10 μmol/L引物2 μL、DNA模板1 μL，无菌去离子水补足50 μL。扩增在BIO-RAD公司的C1000TMThermal Cycler PCR扩增仪上进行，扩增程序如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，符合预测的样品进行双向测序。本试验所用引物的合成及PCR产物序列测定均在北京三博远志生物技术责任有限公司完成。

表1 供试鸡瑽菌菌株及DNA序列

1.4 序列比对及系统进化树构建

测序后的正反向序列使用DNAStar软件包中的SeqMan进行拼接。获得的完整序列用Cluxtal X进行序列比对，去除两端长短不一及模糊比对的部分，使序列长度基本一致[19]。将比对好的ITS序列转换为nexus格式文件后提交到GenBank核酸序列数据库，通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)在线BLAST N检索进行同源性比较，采用Clustal X软件对所测序列进行多序列联配分析，用MEGA 4.0软件中最大似然法构建系统进化树，计算遗传距离[20]。

1.5 最优菌株筛选

培养基YPD经121 ℃灭菌30 min后加入青霉素(10 mg/L)和链霉素(10 mg/L)，振荡摇匀，趁热倒平板，冷却。将黄豆大小的菌落接种于平板培养基的中央，每皿1块，重复3皿，置于25 ℃恒温培养箱内连续培养18 d，采用十字交叉法测定菌落直径，记录菌丝生长速度及生长势。

1.6 最适培养基筛选

选择1.5中生长最优菌株，从粪便、谷粒、蔬菜、果类、腐殖土、木屑六方面设计适合于鸡瑽菌生长的培养基配方(表2)。每一配方中均添加20 g葡萄糖、15 g琼脂、2 g蛋白胨，最后用自来水定容至 1 L，pH值自然，每个配方3个重复，制作方法同PDA培养基，即称取各主料后用自来水煮沸10 min，取滤液。121 ℃灭菌30 min后加入青霉素(10 mg/L)和链霉素(10 mg/L)，振荡摇匀，趁热倒平板，25 ℃黑暗培养29 d，接菌和测定与1.5中方法相同，最终筛选适宜于菌株生长的最优培养基。

表2 供试培养基主要成分及含量 g

1.7 数据分析

试验数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 鸡瑽菌ITS序列的系统发育分析

ITS序列系统分析过程中，将所测的正反向序列使用DNAStar软件包中的SeqMan进行拼接、编辑获得完整ITS序列，以13个鸡瑽菌基因序列为基础，与GenBank中的25个鸡瑽菌属ITS基因序列进行同源性比较，利用Clustal X软件对所得序列进行多序列联配分析，然后进行系统发育分析。由图1可知，本试验所采集供试菌株聚在4个分支内，其中以Termitomycesaurantiacus最多，包括7191、4279、4272、4268、4267、4432、5123、5081，其次为Termitomycessymbiont、Termitomyceseurrhizus，以Termitomycesbulborhizus最少。

2.2 最优鸡瑽菌菌株的筛选

根据组织分离后菌丝生长情况，选择菌丝分布均一且长势较好的8种菌株作为参试对象，结果显示，在YPD培养基上不同鸡瑽菌株生长情况不同，其中菌株4279生长速度最快[(0.65±0.01)mm/d]且菌丝长势浓密，与其他处理相比差异达到极显著水平，随后依次是2871与2878，而4288在培养基上生长最慢且菌丝生长势较差(表3、图2)。总之，鸡瑽菌菌株在YPD培养基上菌丝体生长速度由大到小依次排列为：4279>2871>2878>2874>4268>4267>2885>4288。

图1 基于ITS序列的鸡瑽菌菌株系统发育分析(1 000次重复)表3 不同鸡瑽菌菌株菌丝生长特性

菌株编号萌发时间/d生长势菌落直径/mm生长速度/(mm/d)28718++19.800.55±0.03bB28747+18.750.52±0.05bBC28788+19.600.54±0.07bB28858++16.030.45±0.01cdD426712+++16.380.46±0.01cdCD42688++16.800.47±0.06cCD42798+++23.500.65±0.01aA428811+15.250.42±0.02dD

注：菌丝生长速度为3次重复的平均值±标准差。同列数字后不同小写字母表示在0.05水平有显著差异；不同大写字母表示在0.01水平有极显著差异，下同。菌丝长势：浓密用+++表示，较浓密的用++表示，稀疏用+表示。

图2 不同鸡瑽菌菌株的生长速度

2.3 鸡瑽菌最适培养基的筛选

在不同培养基上鸡瑽菌菌株4279生长情况不同，其中在1号牛粪为主的培养基上生长速度最快[(0.77±0.04)mm/d]且菌丝长势浓密(表4、图3)，与其他处理相比差异达到显著水平，其次是6号苹果为主的培养基与3号韭菜为主的培养基，而在10号木屑为主培养基上生长最慢且菌丝长势较差(图3)。

表4 不同培养基配方对鸡瑽菌菌株4279菌丝生长的影响

图3 不同培养基上鸡瑽菌菌株4279菌丝生长情况

3 结论与讨论

鸡瑽菌作为一种天然绿色、营养健康的食品[21-22]，深受广大消费者的青睐，但其人工驯化栽培至今尚未成功[14]，如今，在外界各种不利因素下，该菌种质资源的保护成为众多相关研究的首要内容。云南鸡瑽菌栖息面积不到世界该菌栖息总面积的10%，但种类占全球种类总数的50%、我国种类总数的83%[9]，因此，云南本地鸡瑽菌遗传多样性探究的意义重大。

目前，ITS分子生物学技术的应用在研究鸡瑽菌种质资源方面已经成熟，众多学者以云南地区市场上售卖的鸡瑽菌为研究对象，发现鸡瑽菌大部分种为云南地区的地方性物种，云南可能是鸡瑽菌新的演化中心[13,15,23-24]，因此，针对云南地方性鸡瑽菌进行研究很有必要。

临沧市作为鸡瑽菌生长最多的地方之一，长期以来，因没有很好的分子特征支持，Termitomyces混合种群的分类一直给相关科研工作造成诸多不便。本研究搜集临沧市不同地域Termitomyces资源，通过测序获得ITS序列，结合GenBank已有的序列特征，系统分析不同来源及不同命名的菌株之间的亲缘关系，并从生物学种分类的角度进行了较好的确认。从得到的系统进化树来看，ITS序列作为变异较大的区域，较好地反映了菌株的聚类特征。所采集供试菌株聚在4个分支内，其中以Termitomycesaurantiacus最多，随后依次为Termitomycessymbiont、Termitomyceseurrhizus，以Termitomycesbulborhizus最少。同时，试验结果发现，在YPD培养基上Termitomycesaurantiacus菌株4279生长速度最快[(0.65±0.01)mm/d]，在1号牛粪为主的培养基上生长速度可达(0.77±0.04)mm/d，且菌丝长势浓密。

综上，本研究系统分析了鸡瑽菌混合种群的分类地位，同时，通过最优菌株和培养基的筛选，为其人工驯化提供理论依据。但因采集样本较少，只对当地最为常见的鸡瑽菌做了初步的探讨，在今后的工作中应增加样品的采集范围与数量，在ITS分子标记的基础上，利用其他分子标记技术，如18S rRNA序列分析、SSR、IGS等对该菌进行深入的研究[25-29]。