黄桂东，彭家伟，梁舒妍，冯结铧，区锡敏，钟先锋

（佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东省传统发酵食品工程技术研究中心，广东省食品流通安全控制工程技术研究中心，佛山市酿造工程技术研究中心，佛山市农业生物制造工程技术研究中心，广东佛山 528000）

适量饮酒有促血液循环，通经活络，祛风除湿等功效[1]。但急性大量饮酒通常会造成人体急性肝损伤；引起诸多不适，如恶心、呕吐、精细运动能力受损、意识模糊和情绪不稳定等，且易导致意外事故（如车祸）发生，严重的甚至导致急性死亡[2]。随着人们生活方式与节奏的变化，我国饮酒人数不断增加，每年由于过量饮酒引起的疾病越来越多，如引起精神障碍、胃溃疡以及脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化等疾病；食道癌、肝癌发病率的升高可能也与饮酒有关[3]。饮酒带来的负面影响已严重威胁到人民的健康和社会的和谐稳定。因此，研发有效的解酒护肝产品仍是学者着重关注的课题。

樟芝（Antrodia camphorata），又名牛樟菇、牛樟芝，属于非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌属、樟芝种、多年生蕈菌类[4]，是台湾地区特有的一类十分稀少的药食两用真菌[5]。近年来，关于樟芝的研究报道越来越多，学者发现樟芝的活性成分主要有三萜类化合物[6]、多糖[7]和安卓奎诺尔[8]等。樟芝具有多种药理活性，如护肝、抗癌、抗炎和抑菌等功效[9,10]。樟芝通常被看作是护肝良药，Liu等[11]人发现樟芝处理组能明显降低酒精损伤后谷丙转氨酶（aspartateamino transferase，AST）和谷草转氨酶（alanineamino transferase，ALT）的水平，提高SOD和GSH-Px的水平；Chiu等[12]人发现樟芝能降低大鼠肝细胞因CCl4慢性损伤而造成的AST、ALT水平升高，能明显降低肝脂过氧化水平和羟脯氨酸含量。但樟芝子实体有“台湾森林红宝石”之称，价格昂贵。为了节约成本，促进其推广，本实验室通过液态发酵，培养樟芝菌，制备了樟芝口服液。拟通过动物实验，探究自制樟芝口服液的解酒护肝功效。以期为樟芝口服液的推广应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验动物：SPF级KM种小鼠，雄性标重，购自南方医科大学动物中心，合格证号：SCXK（粤）2016-0041。

试剂：AST试剂盒、ALT试剂盒、ADH试剂盒、ALDH试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

种子培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、纯水1000 mL。

发酵培养基：马铃薯葡萄糖水24 g、果糖20 g、胰蛋白胨20 g、磷酸氢二钾0.1 g、纯水1000 mL。

实验用药：樟芝口服液，由实验室制得；阳性对照药为金樽海王片，深圳市海王健康科技发展有限公司。

实验用酒：56°红星二锅头酒，北京红星股份有限公司。

设备：VCX800超声波破碎仪，美国SONICS公司；Epoch2微孔板分光光度计，美国伯腾仪器有限公司；7200型可见光分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；ME2002电子分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；SY-1220恒温水浴锅，美国精骐有限公司；ALLEGRA -64R台式高速大容量离心机，美国贝克曼库尔特公司。

1.2 实验方法

1.2.1 樟芝口服液的制备

樟芝口服液工艺流程：樟芝活化与培养→樟芝提取液制备→原料调配→均质→分装→灭菌→成品

樟芝活化与培养：（1）菌种活化：挑取斜面保藏的樟芝菌种于种子培养基，25 ℃恒温振荡器140 r/min培养10 d，活化2～3代。（2）发酵培养：接活化后的种子培养液于发酵培养基中，25 ℃恒温振荡器 140 r/min培养10 d。

樟芝提取液制备：（1）樟芝发酵液处理：将发酵完毕的樟芝用4层纱布过滤，得樟芝发酵液，再经0.22 μm 滤膜过滤，得樟芝液。（2）樟芝菌丝体处理：将过滤的菌丝体，用纯水洗涤干净，于60 ℃烘至恒干，然后用研钵磨至粉状，于超声粉碎仪中提取，反应条件为提取功率40 W、提取时间30 min、料液比1∶20。将提取液于8000 r/min离心10 min，取上清液。混合上述樟芝液发酵液与菌丝体提取上清液，制得樟芝提取液。

樟芝口服液：樟芝提取液 80%（V/V，三萜类化合物含量0.4 mg/mL）、谷胱甘肽2 g/L、牛磺酸2 g/L、水苏糖2 g/L调配制得，然后分装至10 mL棕色西林瓶。

杀菌：杀菌条件为100 ℃，2 min。

1.2.2 小鼠醉酒模型的建立

随机选取小鼠30只小鼠，分3组，每组10只，分别以0.10 mL/10 g、0.15 mL/10 g、0.20 mL/10 g的剂量灌胃 56°红星二锅头。以小鼠“翻正反射”消失与恢复判定醉酒与醒酒[13]，记录小鼠的醉酒耐受时间、醉酒时间、运动情况和死亡情况等。

1.2.3 樟芝口服液解酒实验

1.2.3.1 动物分组

随机选取小鼠50只，分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、低剂量樟芝口服液组和高剂量樟芝口服液组，每组10只。（樟芝口服液为高剂量樟芝口服液，稀释4倍后为低剂量樟芝口服液。）

1.2.3.2 给药方法

小鼠禁食、不禁水12 h后，进行试验。（1）空白对照组：每只小鼠先灌胃0.15 mL/10 g的生理盐水，然后30 min后再灌胃0.15 mL/10 g的生理盐水；（2）模型对照组：每只小鼠先灌胃0.15 mL/10 g的生理盐水，然后30 min后再灌胃0.15 mL/10 g的56°红星二锅头；（3）阳性对照组：每只小鼠先灌胃0.15 mL/10 g的金樽海王片溶液，然后30 min后再灌胃0.15 mL/10 g的56°红星二锅头；（4）低剂量樟芝口服液组：每只小鼠先灌胃0.15 mL/10 g的低剂量樟芝口服液，然后30 min后再灌胃0.15 mL/10 g的56°红星二锅头；（5）高剂量樟芝口服液组：每只小鼠先灌胃0.15 mL/10 g的高剂量樟芝口服液，然后 30 min后再灌胃 0.15 mL/10 g的56°红星二锅头。

1.2.3.3 观察指标

灌酒后观察并记录小鼠醉酒耐受时间、醉酒时间、运动情况及死亡等情况。

1.2.3.4 生化指标的测定

灌胃酒精4 h后，所有小鼠摘眼球取血，3000 r/min离心10 min分离血清；动物采血后颈椎脱臼处死，解剖取出肝脏，取肝脏右叶0.1 g，在0.9%的冰生理盐水，用组织匀浆器制备成0.1 g/mL的肝组织匀浆，3000 r/min，4 ℃冷冻离心15 min，取上清液冷藏、备用。血清按照ALT试剂盒、AST试剂盒说明书操作，测定血清ALT、AST的含量；肝组织上清液按照ADH、ALDH试剂盒说明书操作，测定肝匀浆ADH、ALDH的含量。

1.3 数据统计分析

采用Excel 2010和SPSS 17.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 小鼠醉酒模型的建立

以“翻正反射”的消失与恢复判定小鼠的醉酒与醒酒。由表1的结果显示，低剂量组中有4只出现醉酒现象，仍有6只未醉；高剂量组全部出现醉酒现象，但有3只死亡；中剂量组全部出现醉酒现象，未出现死亡现象，醉酒耐受时间为 14.3±5.8 min、醉酒时间为 258.3±25.2 min。

郑立发[3]等人采用不同剂量 56°红星二锅头白酒建立小鼠醉酒模型时，结果表明0.15 mL/10 g为较佳致醉量，动物可明显致醉且无大量死亡。这与本模型的中剂量组结果一致，因此选用0.15 mL/10 g的剂量作为小鼠醉酒用剂量。

表1 小鼠醉酒模型试验结果Table 1 Results of mice drunk model test

2.2 樟芝口服液对小鼠醉酒情况的影响

不同组别处理对小鼠醉酒结果是不同的。由表 2的结果显示，阳性对照组中有2只未出现“翻正反射”消失，即没醉；而高剂量组有3只未醉。模型组中，小鼠的醉酒耐受时间最短（14.1±5.2 min）、醉酒时间最长（230.0±22.3 min）。与模型对照组相比，低剂量组能显著缩短小鼠的醉酒时间（p＜0.05）；高剂量组能显著延长小鼠醉酒耐受时间，缩短醉酒时间（p＜0.01），醉酒耐受时间分别从 14.1±5.2 min延长到 27.9±7.9 min，醉酒时间从 230.0±22.3 min缩短至 161.7±38.0 min。张明昊[14]等人研究葛花解醒汤对小鼠醉酒模型解酒护肝作用时，翻正实验模型对照组的醉酒耐受时间与醉酒时间分别为20.1±3.2 min与222.4±5.8 min，葛花解醒汤组的醉酒耐受时间与醉酒时间分别为32.2±3.7 min与176.5±6.7 min。该结果与本试验的高剂量组相似，综上表明，樟芝口服液具有一定的防醉、解酒功效。

表2 各试验组小鼠醉酒耐受时间、醉酒时间的情况Table 2 Tolerance time and drunken time of each groups (n=10, ¯x±s)

2.3 樟芝口服液对小鼠血清ALT、AST的影响

根据ALT、AST试剂盒操作指示，测定各组小鼠血清中ALT、AST的活力。表3结果显示，急性灌胃酒精会造成小鼠血清中ALT、AST水平升高，模型对照组 ALT、AST水平均比空白对照组有显著提高（p＜0.01），分别从19.94±7.27 U/L 升高到56.34±9.60 U/L，从36.57±6.84 U/L升高到69.57±11.88 U/L，说明造模成功。与模型组相比，低剂量组的ALT、AST水平稍有下降，但差异不显著；而高剂量组的ALT水平显著降低（p＜0.01），从 56.34±9.60 U/L 降低到42.35±12.29 U/L，AST水平也显著降低（p＜0.05），从69.57±11.88 U/L降低到51.86±15.04 U/L。

ALT和AST水平的高低是衡量机体组织功能是否正常的重要指标，正常情况下在血液中维持一个正常的范围[15]。当摄入急性或毒性物质，如酒精、四氯化碳、有机磷等会引起肝细胞的损伤或坏死，ALT、AST就会大量释放到血液当中[16]，引起含量升高。而高剂量樟芝口服液有抑制因酒精损伤而导致的ALT、AST水平升高的作用，表明樟芝有一定的护肝功效。该结果与李俊鹏[17]在牛樟芝胶囊对大鼠四氯化碳肝损伤的保护作用的结果相似，其发现樟芝胶囊能显著降低因四氯化碳损伤而导致的 ALT、AST水平的升高。

组别 ALT/(U/L) AST/(U/L)空白对照组 19.94±7.27 36.57±6.84模型对照组 56.34±9.60** 69.57±11.88**阳性对照组 41.59±9.90** ## 56.14±10.06 ** #低剂量组 49.53±7.17** 62.57±9.47**高剂量组 42.35±12.29** ## 51.86±15.04**#

注：与空白组对比，*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异极显著；与模型组对比，#p＜0.05表示差异显著，##p ＜0.01表示差异极显著。

2.4 樟芝口服液对小鼠肝组织匀浆 ADH、ALDH的影响

根据ADH、ALDH试剂盒的操作指示，测定小鼠肝组织匀浆中ADH、ALDH活力。表4结果显示，摄入酒精会引起机体ADH、ALDH水平升高，与模型组对比，高剂量组能显著提高ADH水平（p＜0.01），从6.21±1.91 U/mg prot升高到 9.82±3.36 U/mg prot。另外低剂量组虽能提高ADH水平，但效果不显著；对于ALDH，与模型对照组相比，高剂量组能显著提高其ALDH水平（p＜0.05），从454.15±119.18 U/mg升高到454.15±119.18 U/mg。低剂量组在提高ALDH水平上无显著差异。

ADH和ALDH是酒精代谢过程中的关键酶[18]，其水平高低是衡量解酒快慢的重要指标。高剂量樟芝口服液能在机体摄入酒精的情况下，提高 ADH和ALDH的水平，该结果与刘莹[19]研究野葛花解酒作用机理中，野葛花粗提物通过提高ADH、ALDH活力方式具有解酒作用相同。表明樟芝口服液具有解酒的功效。

表4 樟芝口服液对小鼠肝匀浆ADH、ALDH的影响Table 4 Effect of oral liquid on the activity of ADH, ALDH in mice liver homogenates(n=10, ¯x±s)

3 结论

本研究以实验室自制樟芝口服液对KM种小鼠进行灌胃试验，通过比较不同试验组小鼠的醉酒耐受时间、醉酒时间，以及测定小鼠肝组织中ADH、ALDH的活力，探究其对小鼠急性酒精肝损伤的保护作用。研究初步表明，高剂量（0.2 mL/10 g）樟芝口服液能显著延长小鼠醉酒耐受时间和缩短醉酒时间，并且能显著降低因急性酒精中毒而导致的ALT、AST水平升高，表明樟芝有一定的护肝功效。ADH和ALDH含量的高低是机体代谢酒精快慢的重要因素，研究发现，摄入酒精会引起机体ADH、ALDH水平的升高，而高剂量樟芝口服液能更进一步提高试验小鼠肝组织中ADH、ALDH的水平（p＜0.01、p＜0.05），由此推断樟芝口服液的解酒功效是由促进机体合成更多 ADH、ALDH而实现的，表明本试验中自制樟芝口服液具有一定的解酒护肝功效，其原理可能是与促进 ADH、ALDH表达水平升高有关。