李晓林，吴阳升，林嘉鹏，汪立芹，黄俊成*，贾 斌

【研究意义】经卵泡刺激素(FSH)处理一月龄羔羊后，可导致比成年羊多10倍以上的卵泡发育[1]。故以羔羊为供体可以为胚胎体外生产提供大量的卵母细胞资源，从而缩短世代间隔。对卵泡发育相关基因的筛选与功能研究对于绵羊的育种具有重要科学意义和应用前景。我们在比较激素诱导羔羊和成年羊激素诱导后发育卵泡颗粒细胞转录组差异时，鉴定到超过300个基因的在转录水平有显著差异。其中FSH诱导后羔羊血小板糖蛋白4基因(Cluster of differentiation 36 ，CD36)的表达显著下调，而成年羊在激素诱导前后则无显著变化[2]。故推测羔羊卵泡颗粒细胞中存在与成年羊不同的TSP-1信号通路，该通路可能与羔羊卵泡的超数发育数量有关，即与卵泡的募集有关。【前人研究进展】卵泡的发育和排卵需要大量旁分泌、自分泌和内分泌因子的协同作用，该过程中涉及到很多重要的生理过程，如血管生成[3]。卵巢血管生成的重要调节因子是血管内皮生长因子(VEGF)，研究表明CD36是影响小鼠血管和卵泡生成的重要因子[4]。CD36是一种跨膜糖蛋白受体，又被称为脂肪酶转位酶(Fatty acid translocase ，FAT)，B族清道夫受体3(Scavenger receptor class B member 3，SCARB3)等[5]。CD36由CD36基因编码，位于人的7号染色体上，有15个外显子[6]。CD36蛋白由1个包含472个氨基酸的单肽链组成。组织成2个跨膜结构域：2 个非常短的细胞质域和1个大的糖基化的胞外结构域[7]。研究表明，CD36在人类的心脏和肾脏的肌细胞有大量表达[8]，比较明确的作用有影响人血管发生[9]，动脉粥样硬化[10]，炎症和脂类代谢等[11]。目前该基因在绵羊各个组织中的表达和对绵羊卵泡发育是否有影响还未见研究。【本研究切入点】本文以新疆阿勒泰羊为研究对象，利用PCR扩增CD36 CDS区全长，对克隆的CD36的理化性质，二级结构，功能域等进行生物信息学分析，同时构建分子系统进化树。在mRNA水平上分析CD36在不同组织和不同发育时期卵泡中表达差异，【拟解决的关键问题】以期为后续深入研究CD36基因的功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

阿勒泰羊选自新疆畜牧科学院绵羊繁育基地，在1周岁时选取5头健康绵羊进行屠宰，取卵巢和其他其他7个组织(心、肝、脾、肺、肾、肌肉、卵巢)，放于RNA保护剂中，4 ℃保存1夜后提取RNA。

1.2 引物设计

根据GenBank中绵羊CD36基因预测序列(XM_012176586.2)，采用Primer 5.0软件设计了2对引物(1对引物用于扩增CD36基因的CDS序列，1对为实时荧光定量引物)。以GAPDH基因作为内参基因(登录号：AF017079.1)，序列见表1。所有引物自行设计后由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 总RNA提取及cDNA合成

利用Trizol酚-氯仿法抽提绵羊不同组织和不同直径(< 3 mm，小卵泡；3～5 mm，中卵泡；>5 mm，大卵泡)卵泡总RNA。2 %凝胶电泳后于凝胶自动成像仪(Gene)中成像。利用核酸测定仪检测总RNA的纯度和浓度，-80 ℃保存备用。

以各个组织和不同直径卵泡RNA为模板，利用反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)进行cDNA合成。反应体系20 μl：5×TransScriptAll-in-One SuperMix for qPCR 4 μl，gDNA Remover 1 μl，总RNA 1 ng，加ddH2O至20 μl。

1.4 克隆测序

以绵羊第1条cDNA链为模板进行PCR扩增，体系为25 μl：cDNA 2 μl，2× Master SupermixTaq酶(北京全式金有限公司)12.5 μl，上下游引物各1μl，ddH2O 8.5 μl。PCR反应条件: 95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35个循环，72 ℃延伸10 min，10 ℃ 保存。PCR 产物采用DNA柱式胶回收试剂盒(北京全式金)纯化后与pMD19-T载体连接。挑取单克隆菌落，接种于含AMP的0.5 mL LB培养基，37 ℃，200 r/min振荡3～4 h。根据菌液PCR结果，挑选阳性克隆送测序(上海生工)。

1.5 实时荧光定量PCR

以2 μl不同组织cDNA为模板，25 μl体系另外包括：Green qPCR SuperMix 12.5Ul，上下游引物各1 μl，RNase-free H2O 9 μl。PCR反应条件为: 95 ℃预变性30 s；然后95 ℃ 5 s，引物特异Tm15 min，55 ℃ 3 min，循环40次。熔解曲线分析: 95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，然后以0.5 ℃/10 s的速率从55 ℃缓慢递增到95 ℃。反应在Rochol Light Cycler 480 II荧光定量PCR仪上进行，每次每一板上设置标准品、未知样品(各重复3次)和1个阴性对照。

表1 TSP-1基因的PCR扩增及实时荧光定量PCR引物

表2 不同物种CD36 基因GenBank登录号

表3 蛋白质结构功能预测(软件或网址)

1.6 统计分析

基因的mRNA表达定量采用相对Ct(ΔCt)法：目标基因Ct-GAPDHCt. ΔCt值在进行样品间比较(ΔΔCt)：样品2ΔCt-样品1ΔCt。实时荧光定量PCR的最终结果计算公式为2-ΔΔCt。

1.7 系统进化树分析

根据克隆得到的CD36基因序列和从GenBank下载的基因序列核苷酸序列，使用Mega6.0中的邻接法(NJ)构建进化树。不同物种GenBank登录号见表2。

1.8 生物信息学分析

利用DNAMAN软件将CD36的核苷酸序列翻译成氨基酸，通过DNAStar等生物信息学分析软件和在线分析软件预测蛋白的一级结构、理化性质、亲/疏水性和信号肽、二级结构等，预测所要使用的方法见表3。

2 结果与分析

2.1 CD36基因PCR扩增及序列分析

由图1显示，将阿勒泰羊耳组织CD36基因CDS区序列进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测得到片段长度为1614 bp，条带单一，片段长度与预期大小相符。

2.2 CD36基因CDS区序列及蛋白功能位点分析

由图2表示，经测序和拼接后，得到1419 bp的CDS区全长，共编码472个氨基酸。与预测序列(登录号：XM_012176583.2)相比，CD36的编码区序列完全一致，不存在变异位点。

M：BM2000 DNA marker；1：CD36 PCR扩增结果；2：阴性对照图1 CD36基因PCR扩增产物Fig.1 PCR amplification product of CD36 gene

图2 绵羊CD36基因核苷酸序列及翻译氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and translated amino acid sequence of CD36 gene in sheep

2.3 蛋白结构与功能分析

利用在线软件分析，CD36蛋白分子式为C2411H3769N615O680S18，原子总量为7491，分子量约为52.8 ku, 带正电荷和负电荷的氨基酸残基数分别为45和50个，其理论等电点pI为8.50；经计算CD36蛋白不稳定系数为32.61(<40)，脂肪指数为97.01,最大疏水性位于第9位氨基酸(Score: 2.433)，最大亲水性位于457位氨基酸(Score: 3.178)；整体来看亲水性区域大于疏水性区域，总平均亲水性为0.021(>0)(图3)；信号肽分析结果显示CD36蛋白原裂解位点(C值)在和联合裂解位点(Y值)在氨基酸21位评分最高(0.186和0.224)，信号肽存在于氨基酸的1～20位(图4)；跨膜区分析CD36蛋白存在两个跨膜螺旋结构，分别位于氨基酸的7～29位和441～463位(图5)；二级结构分析TSP-1蛋白含22个a螺旋(alpha helix) ，31个β折叠延伸链(extended strand)， 24个转角(turn)和15个无规则卷曲(random coil)(图6)。

图3 绵羊CD36蛋白的亲/疏水性分析Fig.3 Hydrophilic/hydrophobic analysis of CD36 protein in sheep

图4 绵羊CD36蛋白信号肽分析Fig.4 Signal peptide analysis of CD36 protein in sheep

图5 绵羊CD36蛋白跨膜区域分析Fig.5 Transmembrane domain analysis of CD36 protein in sheep

利用在线软件分析CD36蛋白的功能位点发现，可能存在8个N-糖基化位点，分别位于氨基酸的79，102，172，205，233，247，321，417位；该蛋白还存在41个潜在的磷酸化位点，包括19个Ser，15个Thr和7个Tyr(图7)。

2.4 系统进化树分析

利用 Mega 6.0软件构建物种间分子系统进化树，其中，人与猕猴聚为一类，灰雁、山羊和原鸡聚为一类，不同种属鼠聚为一类，鲤鱼、斑马鱼与其他物种的遗传距离较远，绵羊与牛，水牛的遗传距离较近(图8)。

2.5 CD36基因在绵羊在7个组织及不同直径卵泡中的表达谱检测

通过实时荧光定量PCR检测了CD36基因在5头阿勒泰羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、卵巢以及不同直径卵泡中表达变化。结果发现CD36基因在7个组织中都有表达，其中在心脏、卵巢等中高表达，在脾脏、肝脏和脾脏中等表达，在肌肉中低表达。其中心与肺中CD36表达量差异显著(P<0.05)。在不同直径卵泡中CD36总体表达量较低，其中中卵泡中CD36表达量最高，大卵泡次之，小卵泡中表达量最低，其中小卵泡与心表达量差异显著(P<0.05，图9)。

图6 绵羊CD36蛋白二级结构分析Fig.6 Secondary structure analysis of CD36 protein in sheep

图7 CD36蛋白存在的N-糖基化和磷酸化位点Fig.7 N-glycosylation and phosphorylation sites in CD36 protein

图8 NJ法构建系统进化树Fig.8 Phylogenetic tree constructed by NJ method

图9 CD36基因在绵羊组织中表达情况Fig.9 Tissues expression profile of CD36 gene in sheep

3 讨 论

卵母细胞的成熟离不开卵泡液和颗粒细胞，卵泡液是前者发育成熟的重要场所，而颗粒细胞分泌的蛋白和激素则调节卵母细胞的发育[12]。CD36又称脂肪酸移位蛋白，是一种糖基化蛋白，可以结合多个配体，介导不同的生物学过程。 如CD36结合血小板反应蛋白1(TSP-1)通过抑制NO/cGMP信号途径抑制血管生成[13]；CD36能在低密度蛋白(LDL)氧化过程中通过识别氧化磷脂(oxPLs)调节细胞摄取氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)[14]；在作为脂肪酸移位酶时，CD36同长链自由脂肪酸结合且有助于后者转运至细胞内[15]。

研究表明，CD36在多种动物卵巢组织中表达且对卵泡发育有一定作用，如敲除CD36基因的小鼠，卵巢上表皮生长因子(VEGF)和其受体VEGFR-2表达均上调，同时排卵前卵泡数量显著增加，黄体数量却显著降低[16]。CD36在大鼠窦状卵泡早期和黄体期的颗粒细胞中均有表达[17]。随着牛卵泡直径的的增大，卵泡液中的CD36蛋白含量逐渐降低，同时在卵巢黄体形成过程中，CD36的下调有助于黄体上血管爆发式生长[18]。作为一种存在于多种细胞中的跨膜蛋白，近年来CD36在肿瘤中的表达与预后关系研究中较多，已经明确的是CD36调节多种功能：参与血管生成，动脉粥样硬化、炎症和脂质代谢[19-21]。在FSH超排处理羔羊和成年羊后，比较分析转录组数据推测，CD36可能在绵羊卵泡发育中具有调控作用。

本研究通过PCR扩增获得CD36 基因CDS区序列。与NCBI上的预测序列对比发现一致。系统进化树分析表明绵羊与牛，水牛的遗传距离较近。将克隆到的核苷酸序列及翻译成的氨基酸进行生物信息学分析发现，CD36蛋白分子量约为52.8 ku，整体来看亲水性区域大于疏水性区域。对其跨膜结构和信号肽进行分析后发现，CD36蛋白存在2个跨膜结构区，在氨基酸的1～20位有一个信号肽。若蛋白质序列含有跨膜区表明其可能是以膜受体的形式发挥作用，也可能是定位于膜上的锚定蛋白或离子通道蛋白，信号肽则是引导新合成的蛋白质向分 泌通路转移的短肽链。故本研究的结果表明，CD36蛋白蛋白可能是以膜蛋白的形式发挥其生物学作用。糖基化和磷酸化都是生物体内蛋白质翻译后重要的修饰方式，通过在线软件分析后发现，CD36蛋白可能存在8个N-糖基化和41个潜在的磷酸化位点。结果表明CD36蛋白在翻译后中有丰富的修饰。

研究CD36基因在绵羊各个组织中的表达和分布，对进一步了解该基因的蛋白表达定位、作用的靶组织、及可能作用的功能部位均有重要意义。研究表明，CD36在小鼠，大鼠，牛等动物的各个组织中均有表达[22-24]。但在绵羊各个组织中的表达和分布报道较少；CD36基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、卵巢这7个组织中都有表达，在心脏、卵巢等中高表达，在脾脏、肝脏和脾脏中等表达，在肌肉中低表达。表明CD36 基因具有广泛的组织表达特征，在绵羊生长过程中可能存在广泛的生物学作用。不同卵泡直径卵泡中CD36表达量存在差异，其中CD36 在直径为3～5 mm卵泡中表达量最高，在直径< 3 mm卵泡中表达量最低。这在一定程度上反映了CD36 基因可能在绵羊卵泡发育中具有重要作用。本研究初步探讨了CD36 基因的结构和功能，但该基因在卵泡发育过程中的作用和机制需进一步探讨。

4 结 论

本研究利用PCR扩增和克隆测序获得了CD36基因CDS全长为1419 bp，共编码472个氨基酸。CD36蛋白为脂溶性亲水蛋白，具有1个跨膜螺旋结构，在氨基酸1～20位存在信号肽，存在8个N-糖基化和41个潜在的磷酸化位点，包括19个Ser，15个Thr和7个Tyr。系统进化树分析显示，绵羊与牛的亲缘关系较近，与人、小鼠和鸡等禽内亲缘关系较远。检测不同组织和不同直径卵泡中CD36 基因发现：心与肺和小卵泡中CD36 表达量差异显著(P<0.05)，在不同直径卵泡中总体表达量较低。