谭小兵，朱 媛，杨焕文，王 戈*，白羽祥，吕世保，程亚东

(1.云南农业大学烟草学院，云南 昆明 650201; 2.云南省农业科学院农业经济与信息研究所，云南 昆明 650205)

【研究意义】烤烟是中国主要经济作物之一，属于茄科(Solanaceae)忌连作作物，但由于可用耕地面积有限和生态条件等因素，导致连作现象普遍存在。据统计，中国烤烟连作面积占烤烟总种植面积的30 %～60 %，经济损失严重[1]。长时间连作会造成土壤有毒物质积累，理化性状恶化，同时微生物结构失衡，且烟叶产质量降低，病虫害发生率显著增加[2-4]，严重制约了中国烟叶生产的可持续发展。【前人研究进展】自毒作用(autotoxicity)是植物根分泌和残茬降解时释放出的次生代谢物对其自身或种内植物产生危害的一种现象[5]，许多作物连作障碍与此密切相关[6]。目前，国内外已有不少有关根系分泌物与连作障碍关系的研究报道。相关研究表明，根系分泌物会显著抑制烤烟幼苗的生长发育及其生理代谢过程[7-9]。【本研究切入点】至今有关烤烟根系分泌物与烤烟产生连作障碍方面的研究甚少，更没有对根系分泌物自毒物质进行分离鉴定。【拟解决问题】本试验在水培条件下提取烤烟根系分泌物，通过外源添加模拟连作条件，研究根系分泌物对自身种子萌发和幼苗生理指标的影响，旨在探讨烤烟根系分泌物对连作障碍的影响，为丰富烤烟连作障碍机理提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试品种为烤烟主栽品种红花大金元(以下简称红大)，供试种子为裸种，由南方育种中心提供，将红大种子用2 %的硫酸铜消毒15 min，催芽后播于育苗盘上，采用常规烤烟漂浮育苗。

1.2 根系分泌物收集

根系分泌物收集在云南农业大学化学楼完成。采用水培法收集，具体步骤为：红大幼苗(4叶1心)时进行营养培养试验，营养液采用Hogland营养液和Amon微量元素营养液，培养液以淹没根部为度，每天加去离子水至规定刻度，定时通氧；每3 d测1次pH，调整pH至6.0±0.2，每周更换1次营养液。营养液培养两周后收集根系分泌物，将烟苗从营养液中取出，去离子水冲洗干净后，将烟苗放入用锡箔纸包裹的盛有无菌去离子水的三角瓶中培养(原光条件下)，每天收集6 h(9:00-15:00)，连续收集5 d，合并收集液后制成浓度为1.00 g/mL(表示1 mL水溶液中含有1.0 g植物鲜重的根系分泌物)根系分泌物母液，加入几滴5 mg/L百里酚溶液后密封置入-20 ℃低温下冷藏备用。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计 将4叶1心烟苗移入塑料盆钵(9.5 cm×9.0 cm×11.5 cm)培养，基质为烟草专用育苗基质，每盆定植3株，向内添加200 mL营养液(Ca(NO3)2·4H2O 1.18 g/L，KNO30.51 g/L，MgSO4·7 H2O 0.49 g/L，KH2PO40.14 g/L)，第5叶完全展开时一次性添加不同浓度根系分泌物水溶液50 mL，浓度梯度为0(CK)、0.25、0.50和1.00 g/mL，3次重复，每天每盆定量添加20 mL蒸馏水，培养20 d后采集幼苗叶片和根系测定相关指标。

1.3.2 指标测定及方法 ①根系分泌物对种子萌发的影响:准确吸取3个浓度的根系分泌物10 mL加入到铺有滤纸的培养皿内，每个培养皿整齐排入50粒红大种子(裸种)，每处理3个重复，26 ℃下光照培养箱中黑暗培养14 d后调查发芽率。②根系分泌物对幼苗生长和生理指标的影响。生物性状及总叶绿素测定：取样后立即测量各处理株高和根长，用吸水纸吸干后测量地上和地下部分鲜重。用日产SPAD-502测定烟苗叶片总叶绿素含量的相对值。每个处理测定3株。根系活力、pH值及相对电导率测定：采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[10]测定红大根系活力，pH值采用PHS-2C酸度计测定，用电导率仪(上海雷磁仪器厂)测定烟苗的相对电导率。氧化酶活性测定：SOD、POD和CAT活性测定参考李合生[10]的方法。SOD活性采用NBT-还原法，POD酶活性采用愈创木酚法，CAT以每分钟减少0.01为一个酶活力单位(U/g·min FW)，通过测定OD532、OD600和OD450值，按公式C(μmol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450计算MDA含量。

1.4 数据处理和统计方法

实验数据采用Excel 2010和SPSS 19.0进行处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对红大自身种子发芽率和幼苗生长的影响

从表1可见，红大根系分泌物会显著降低红大种子发芽率和各项生物性状指标。随着分泌物浓度的增加种子发芽率显著降低，表现为1.00 g/mL<0.50 g/mL<0.25 g/mL

表1 不同处理对红大种子发芽率和幼苗生长的影响

注：数据为平均数±标准差，n=3。表中同列不同小写字母表示不同处理之间差异达到显著水平(P<0.05)，下同。

Note: The data are means ± standard deviation,n=3. Different lowercases in the same column indicate significant difference in different treatments at 5 % level. The same as below.

2.2 不同处理对红大幼苗生理特性的影响

2.2.1 对叶绿素总量(SPAD)的影响 随根系分泌物浓度增加红大幼苗总叶绿素含量显著降低(图1)，浓度为0.50 g/mL和1.00 g/mL较CK幼苗叶绿素含量分别显著降低了39.18 %和54.64 %；低浓度(0.25 g/mL)幼苗叶绿素含量较CK降低4.42 %，两者差异未达到显著水平。表明根系分泌物会抑制叶内叶绿素合成，从而降低植株光合速率，进而影响烟株物质合成。

2.2.2 对根系活力的影响 从图2可见，根系分泌物对红大幼苗根系活力具有显著的抑制作用，且各处理浓度间达到了显著水平。幼苗根系活力随着根系分泌物浓度的增加逐渐下降，表现为CK>0.25g/mL>0.50 g/mL>1.00 g/mL，其中在低浓度(0.25 g/mL)时根系活力237.81 μg/h,FW较CK 266.09 μg/h,FW显著降低了10.63 %，降幅最小；高浓度(1.00 g/mL)时根系活力为75.59 μg/h,FW相比CK降幅最大为71.59 %。说明根系分泌物中自毒物质严重抑制了根系的生长发育。

数据为平均数±标准差，n=3。不同小写字母表示不同浓度处理间差异显著(P<0.05)，下同The date are means ± standard deviation of three replicates. Different small letters indicate significant different among treatments(P<0.05), the same as below图1 不同处理对红大幼苗总叶绿素含量的影响Fig.1 Effect of different treatments on Chl content(SPAD)

图2 不同处理对红大幼苗根系活力的影响Fig.2 Effect of different treatments on root activity

2.2.3 对叶片和根际pH值的影响 不同的根系分泌物浓度对红大幼苗叶片和根际pH影响显著(图3)。表现为随着根际分泌物浓度的增加红大根际pH逐渐降低。同时随着分泌物浓度的增加幼苗叶片的pH值表现出先降低后上升的趋势，在浓度为0.50 g/mL时达到最小，且3个浓度处理均显著低于CK，分别较CK降低4.26 %、8.34 %、5.40 %。

2.2.4 对红大叶片和根系电导率的影响从图4可见，各处理之间叶片和根系导电率均表现为1.00 g/mL>0.50 g/mL>0.25 g/mL>CK。其中叶片相对电导率较CK分别提高4.24 %、6.59 %和8.69 %，根系相对导电率较CK分别提高8.11 %、16.33 %和19.23 %，且各处理之间差异显著。表明烤烟根系分泌物中存在某些化学物质使细胞膜透性受到破坏，浓度越高破坏程度越大。

2.3 不同处理对红大幼苗保护酶活性和膜脂过氧化物的影响

2.3.1 对POD活性的影响 根系分泌物对红大幼苗内POD活性存在不同程度的影响(图5)。叶片POD活性表现为1.00 g/mL>0.50 g/mL>0.25 g/mL>CK，呈现出随着处理浓度的增加而增加的趋势，其中高浓度(1.00 g/mL)较CK显著提高57.04 %，且与0.50 g/mL与0.25 g/mL也达到显著水平；幼苗根系POD活性随根系分泌物浓度增加呈现先增后降的趋势，在0.5 g/mL时达到最大值，较CK提高35.71 %，同时低浓度(0.25 g/mL)和高浓度(1.00 g/mL)较CK也分别提高了19.55 %、7.30 %。说明根系分泌物会导致烟苗体内活性氧水平增加，从而诱导POD活性的提高。

图3 不同处理对红大幼苗叶片和根际pH值的影响Fig.3 Effect of different treatments on pH value in leaves and rhizosphere

图4 不同处理对红大幼苗叶片和根系相对电导率的影响Fig.4 Effect of different treatments on relative conductivity in leaves and root

图5 不同处理对红大幼苗叶片和根系POD活性的影响Fig.5 Effect of different treatments on POD activity in leaves and root

2.3.2 对红大SOD活性的影响 从图6可见，随根系分泌物浓度增加幼苗叶片和根系SOD活性表现为先增后降的趋势。幼苗根系SOD活性在0.25 g/mL时最高为144.83 U/g·min,FW，显著高于其他处理，且在高浓度1.00 g/mL时活性最低为126.12 U/g·min,FW，显著低于其他处理，与CK相比下降7.31 %。幼苗叶片SOD活性在0.50 g/mL是最高，表现为0.50 g/mL>1.00 g/mL>0.25 g/mL>CK，且各浓度处理SOD活性均显著高于CK，进一步证明根系分泌物会对抗氧化酶系统产生破坏，诱导了SOD活性的升高。

2.3.3 对红大CAT活性的影响 从图7可见，随着根系分泌物浓度的增加，红大幼苗叶片和根系CAT活性呈先增加后降低的趋势。2者均在作用浓度超过0.25 g/mL后开始下降，在1.00 g/mL达到最低。低浓度(0.25 g/mL)处理根系和叶片中CAT活性显著高于其他处理，说明自毒物质含量较低时诱导烟株体内CAT活性增加以降低自毒物质伤害；但随处理作用浓度增加，根系和叶片中CAT活性显著降低，其中高浓度(1.00 g/mL)处理与CK相比根系中CAT活性显著下降24.85 %，叶片中CAT活性显著下降7.55 %，说明随着浓度的增加，烤烟幼苗对根系分泌物中的自毒物质耐受力降低。

图6 不同处理对红大叶片和根系SOD活性的影响Fig.6 Effect of different treatments on SOD activity in leaves and root

图7 不同处理对红大幼苗叶片和根系CAT活性的影响Fig.7 Effect of different treatments on CAT activity in leaves and root of tobacco

2.3.4 对红大MDA含量的影响 从图8可见，随着根系分泌物浓度增加红大幼苗叶片和根系MDA含量逐渐升高。高浓度(1.00 g/mL)处理与CK相比叶片中MDA含量增加39.34 %，且显著高于0.25和0.50 g/mL处理，同时高浓度(1.00 g/mL)处理与CK相比根系中MDA含量增加65.69 %，两者差异显著，且1.00与0.25 g/mL处理之间差异也达到显著水平。说明根系分泌物导致膜脂过氧化程度加剧，膜系统受到严重损伤，植株抗逆性降低。

3 讨 论

植物产生连作障碍是植物与土壤环境共同作用的结果。其中植物化感自毒作用是连作障碍发生的一个重要原因，而自毒作用主要依赖于植物根系分泌物质到环境中抑制植物生长[11]。据相关研究报道，根系分泌物中的自毒物质通过影响土壤理化性状、土壤微生物结构、细胞膜透性、抗氧化酶系统、营养状况以及病虫害发生率等多方面来抑制植物的生长发育[12-13]。

图8 不同处理对红大叶片和根系MDA的影响Fig.8 Effect of different treatments on MDA content in leaves and root of tobacco

本试验结果表明，红大根系分泌物会显著抑制红大种子发芽率、株高、根长、地上部分以及地下部分鲜重，表现在随着根系分泌物浓度的增加抑制作用增加，在高浓度(1.00 g/mL)表现出明显的抑制作用，这与前人研究结果一致[14]。表明了烤烟根系分泌物中存在抑制自身种子萌发和生长发育的有毒物质。同时这种抑制作用在根长、地上以及地下部分鲜重上表现极为明显，可能原因是根系是与自毒物质直接接触的器官，从而影响植株对养分和水分的吸收，导致生长发育受阻。有研究表明根系较其他器官对自毒物质的响应更加敏感[15]。本研究结果中，根系分泌物会显著降低幼苗总叶绿素含量、根系活力以及烟株的pH。说明根系分泌物会导致烟株光合能力降低，破坏细胞膜通透性，加大离子渗透量以及使根系还原能力下降。相关研究结果表明，根系分泌物中有机酸以及酚酸类物质会抑制烟株光合作用，降低叶绿素含量以及根系长度[16-20]，这与本研究结果一致。SOD、POD和CAT活性是植株内抗氧化酶系统的重要组成部分，对于植株抗逆性系统稳定性具有重要作用。本试验结果表明，根系分泌物会破坏幼苗体内抗氧化酶系统。表现为幼苗内SOD、POD和CAT活性的增加以降低自毒物质对烟苗抗氧化酶系统的破坏。除幼苗叶片POD活性随着处理浓度增加而增加外，其他SOD、POD和CAT活性均随着处理浓度的增加呈现出先升高后降低的趋势，这是因为随着根系分泌物浓度增大，使得自毒物质也随之增加，导致幼苗体内抗氧化酶系统遭受破坏，抗逆性性降低，使得酶活性受到抑制，且不同的酶对这种毒害作用的耐受力不同，进而导致各种酶活性降低时的根系分泌物作用浓度不同[12]。同时，根系分泌物也会导致烟苗体内MDA含量增加。这也进一步说明植株抗氧化酶系统受到严重破坏。相似的研究结果也有过报道[21-22]。

4 结 论

在烤烟根系分泌物中的确存在自毒物质，并且会随着此类物质的浓度以及含量的变化而产生不同的自毒效应。表现为种子发芽率、烟苗素质、光合作用等受到抑制、抗氧化酶系统受到严重破坏，从而导致烤烟生理代谢受到破坏，进而影响烟株生长发育。这也可以在一定程度上解释随着烤烟连作年限的增加，土壤中有毒物质不断累积，导致烤烟产质量大幅降低，病虫害急剧增加等现象。为进一步弄清烤烟连作障碍机理，还有必要对根系分泌物种类和含量进行定性定量分析，以确定自毒物质种类及致毒含量。