王掌军，刘 妍，王 姣，付青青，刘凤楼，张双喜，张文杰，张晓岗，刘生祥

(1.宁夏大学 农学院, 宁夏 银川 750021； 2.宁夏农林科学院 农作物研究所，宁夏 银川 750001)

【研究意义】由于长期的人工选择和栽培，导致小麦大量优异基因丢失及遗传基础日趋狭窄、脆弱，进而限制了小麦产量和品质的提高，同时，由于育种家一贯追求矮秆、高产的育种目标，加之近年来水肥条件和群体密度提高且品种单一化种植，使得小麦极易受到全球气候变化和病、虫害的侵染[1-2]。收集和利用种质资源是拓宽小麦遗传多样性的基础，同时，种植抗病品种是防治小麦白粉病最经济、有效、环保的措施[3]。【前人研究进展】国内各地区从评选地方品种起步都选了一批优良地方品种在生产上推广，建国以来，我国先后育成了大量的优良品种，每年在生产上种植的小麦品种近400个，种植面积在66.7万hm2以上的品种累计有60多个[4]；同时积极从国外引入品种择优与当地品种杂交，进而对小麦遗传改良，效果显著，尤其是矮秆基因的利用使株高降低、收获指数提高、穗粒重增加，使得品种产量潜力有了巨大提高[5]。另外，经一些科技工作者的不懈努力，将小麦近缘种蕴含的抗病虫害、抗逆、高蛋白等优异基因导入小麦背景中，在生产上发挥着巨大的作用[6-7]。自1930年，澳大利亚学者Waterhouse首次报道小麦品种 Thew 携带一对显性抗病基因，以后各国科学家对抗小麦白粉病基因遗传及染色体定位进行了广泛的研究。小麦白粉病是由禾布氏白粉菌 (Blumeriagraminisf. sptritici) 引起的真菌病害，主要通过影响功能叶片的光合作用而造成小麦减产，在病害发生的一般年份可使小麦减产5 %～34 %[8]，而连续近3年白粉病成为宁夏春麦区小麦生产中的第一大病害，抗白粉病基因的发掘和利用是小麦育种工作的当务之急。目前，国际上正式命名了54个位点(Pm1～Pm54)，鉴定出78个抗白粉病基因，主要来源于普通小麦本身及小麦近缘种属，并且多数基因在染色体上有明确定位[9-13]。尤其携带Pm8、Pm17和Pm20等抗白粉病基因的小麦-黑麦1RS/1BL易位系在世界小麦育种中应用最为广泛[14-17]。近年来，携带Pm21基因的小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系已广泛应用于国内小麦育种中，育成了一系列抗白粉病的品种[18-21]。【本研究切入点】本研究针对宁夏小麦品种资源相对匮乏及本地小麦品种抗病性差等特点，而连续近3年白粉病成为宁夏春麦区小麦生产中的第一大病害。而且宁夏现有的自育和外引小麦材料在农艺性状和抗白粉病基因分布方面缺乏系统的鉴定资料。【拟解决关键问题】对不同来源、不同倍性的小麦种质从农艺性状和白粉病抗性进行鉴定，以期鉴定一批农艺性状优良、抗病性强的材料为丰富当地小麦种质资源遗传多样性及在育种上利用，为抗白粉病分子标记辅助选择奠定基础，以及明确白粉病抗性基因的合理布局和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料共81份(表1)，包括24份地方品种(宁夏6份，外省12份，国外6份)、57份育成品种(宁夏28份，外省29份)，均由宁夏大学小麦育种课题组提供。2016年3月7日将其种植于宁夏大学教学实验农场，每个材料种植1个小区，每小区5行，行长1.1 m，行宽0.2 m，生育期管理同大田。详细观察记载各材料的生长特性、生育时期和形态性状。

1.2 试验方法

1.2.1 田间观察记载 记载各个生育时期(包括出苗期、分蘖期、拔节期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期、成熟期等)，并对不同时期性状观察记录(包括抗病性、株型、抗倒伏等)。

1.2.2 农艺性状考察 株高、穗下茎长和穗长采用直接测量法，用卷尺测量，在考种表上直接记录。有效穗数为每个单株上总的穗数；小穗数和结实小穗数采用直接观测法，其中，结实小穗数=有效小穗数-不孕小穗数。穗粒数和穗粒重以每个株系随机选取15个单穗的粒数并称重，分别取其平均值作为穗粒数和穗粒重；千粒重为1000粒种子称重(3次重复)。经济系数为收获小区全部单株，经济系数=经济产量/生物学产量，其中，生物学产量为收获后未脱粒前的植株(中途未取样的小区)重量，经济产量为脱粒后的籽粒重量。株型分为直立、松散和倒伏3个类型。芒性为长芒、短芒、顶芒和无芒类型。

1.2.3 分子标记分析 基因组DNA的提取采用SDS法[22]。根据已发表的白粉病抗性基因标记设计引物(表2)，由上海生工生物有限公司合成。PCR反应体系(10 μl)：10× Reaction Buffer 1 μl，MgCl2(25 mmol·L-1)0.8 μl，dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.8 μl，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μl，模板DNA 50 ng，TaqDNA聚合酶0.5 U，加ddH2O至总体积10 μl。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物检测：采用8 %聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳时总电压为150 V，电泳1.5 h左右，经银染后观察并照相，并统计扩增条带。

表1 小麦供试材料名称、来源、系谱

表2 白粉病抗性基因标记信息

1.2.4 白粉病成株期田间鉴定 种植引自长江中下游感白粉病品种“苏麦3号”诱发繁殖白粉病，采用收集于宁夏地区的白粉菌混合小种接种于分蘖期小麦。抽穗期分级标准参考0～9级的分级标准，即：0级为免疫(immue, I)、 0;级近免疫(nearly immue, NI)、1～2级高抗(highly resistant, HR)、3～4级中抗(moderate resistant, MR)、5～6级中感(modrate susceptible, MS)、7～8级高感(highly susceptible, HS)、9级极感(extremely susceptible, ES)[32]。

1.2.5 数据处理 采用Microsoft Excel 2010处理数据并作图，用DPS 7.05进行差异显著性、相关性和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 小麦种质资源农艺性状变异及相关性分析

2.1.1 农艺性状的变异 对81份小麦种质10项指标统计分析，由表3表明，其中，9个农艺性状变异系数依次为有效穗(14.77 %)﹥穗粒重(14.41 %)﹥穗粒数(8.94 %)﹥穗下茎长(7.03 %)﹥结实数(5.69 %)﹥小穗数(5.03 %)﹥穗长(4.98 %)﹥株高(3.21 %)﹥千粒重(0.65 %)；同时，株高、穗下茎长和有效穗的变异幅度较大，分别达到极显著、极显著和显著水平。

表3 小麦农艺性状变异性分析

注：*和**分别表示在0.05和0.01水平的F值。

Note: * and ** meanFvalue at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

表4 小麦农艺性状相关分析

注：* 和 ** 分别表示在0.05和0.01水平的显著相关。

Note: * and ** mean significant correlation at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

2.1.2 农艺性状间的相关性 对10项农艺性状指标间进行相关性分析，从表4中看出，株高与所有其他性状相关性不明显；穗下茎长与有效穗(相关系数为0.73)、穗长(0.31)、小穗数(0.24)、结实数(0.24)，有效穗与穗长(0.35)，穗长与小穗数(0.32)、结实数(0.28)、穗粒数(0.22)、穗粒重(0.18)，小穗数与结实数(0.95)、穗粒数(0.45)、穗粒重(0.24)，结实数与穗粒数(0.49)、穗粒重(0.26)，穗粒数与穗粒重(0.74)，穗粒重与千粒重(0.41)、经济系数(0.40)，千粒重与经济系数(0.63)，以上农艺性状指标间均呈极显著正相关。其他性状间相关性不显著或为不同程度负相关。

2.2 小麦种质资源基于农艺性状的聚类分析

以株高、穗下茎长、有效穗等10项农艺性状指标的考种数值进行聚类分析，在距离为21.83时，将81份供试材料分为7个(Ⅰ～Ⅶ)类群，其中，第Ⅰ类群包括22份材料、第Ⅱ类群包括54份材料、第Ⅲ～Ⅶ类群各为1份材料(图1)。

农艺性状类群间分析表明：株高(图2A)，群组Ⅰ﹥Ⅶ﹥Ⅵ﹥Ⅳ﹥Ⅲ﹥Ⅴ﹥Ⅱ；穗下茎长(图2B)，Ⅲ﹥Ⅵ﹥Ⅰ﹥Ⅳ﹥Ⅴ﹥Ⅱ﹥Ⅶ；有效穗(图2C)，Ⅰ﹥Ⅱ﹥Ⅲ=Ⅵ=Ⅶ﹥Ⅴ﹥Ⅳ；穗长(图2D)，Ⅵ﹥Ⅰ﹥Ⅱ﹥Ⅲ﹥Ⅳ﹥Ⅴ﹥Ⅶ；小穗数(图2E)，Ⅶ﹥Ⅴ=Ⅵ﹥Ⅳ﹥Ⅰ﹥Ⅱ﹥Ⅲ；结实小穗数(图2F)，Ⅶ﹥Ⅴ﹥Ⅵ﹥Ⅳ﹥Ⅰ﹥Ⅱ﹥Ⅲ；穗粒数(图2G)，Ⅵ﹥Ⅶ﹥Ⅴ﹥Ⅱ﹥Ⅰ﹥Ⅲ﹥Ⅳ；穗粒重(图2H)，Ⅵ﹥Ⅴ﹥Ⅶ﹥Ⅱ﹥Ⅲ﹥Ⅰ﹥Ⅳ；千粒重(图2I)，Ⅵ﹥Ⅱ﹥Ⅲ﹥Ⅰ﹥Ⅴ﹥Ⅳ﹥Ⅶ；经济系数(图2J)，Ⅵ﹥Ⅱ﹥Ⅲ﹥Ⅰ﹥Ⅶ﹥Ⅴ﹥Ⅳ。总体上，第Ⅰ类群的22份材料平均有效穗最多(6.83±1.986)个，第Ⅱ类群的54份材料平均株高最矮(83.94±13.429)cm，第Ⅲ类群的1份材料穗下茎节最长(51.50±0.500)cm，第Ⅵ类群的1份材料的穗长、穗粒数、穗粒重、千粒重、经济系数均最高(11.00±2.370)cm、(61.00±4.359)粒、(2.69±0.303) g、(44.13±0.006) g、0.533，第Ⅶ类群的1份材料的小穗数和结实小穗数均最多(24.33±1.528)和 (23.33±1.528)个。

图2 7群组小麦品种的农艺性状指标Fig.2 Agronomic trait index of 7 group varieties of T.aestivum

2.3 小麦种质资源白粉病抗性基因的分布及抗病性鉴定

根据已发表的白粉病抗性基因Pm2、Pm4a、Pm6、Pm8、Pm12、Pm13、Pm16/Pm30、Pm21、Pm24等标记设计引物，检测这些基因在81份小麦种质中的分布、并进行田间抗病性鉴定(图3，表5)，其中，Pm12、Pm13、Pm16/Pm30、Pm24等4个基因标记均在供试材料中未扩增出特异性条带。从表5可以看出，根据其他5个标记检测结果分为5类： ①任何基因均未得以检测的材料4份(编号9、10、11、19)；②仅一个基因得以检测的材料11份，其中，Pm2 10份(编号12、15、36、41、50、54、57、58、60、78)、Pm8 1份(编号13)；③聚合2个基因的材料23份，其中，Pm2+Pm4a4份(编号14、53、59、79)、Pm2+Pm6 4份(编号27、42、46、81)、Pm2+Pm8 13份(编号17、20、23、32、35、37、38、39、43、45、51、52、61)、Pm2+Pm21 2份(编号66、74)；④聚合三个基因标记的材料38份，其中，Pm2+Pm4a+Pm8 16份(编号1、2、3、4、5、6、7、16、21、22、24、25、26、28、56、62)、Pm2+Pm4a+Pm21 10份(编号63、64、65、67、68、69、72、73、75、77)、Pm2+Pm6+Pm8 10份(编号8、18、29、30、31、33、34、44、47、48)、Pm2+Pm8+Pm21 2份(编号55、76)；⑤ 聚合4个基因的材料5份，其中，Pm2+Pm4a+Pm6+Pm8 2份(编号40、49)、Pm2+Pm4a+Pm8+Pm21 3份(编号70、71、80)。

泳道上方数字为材料编号，左方为分子量大小，箭头指向为Pm21基因标记的特异条带。M为DNA marker DL 100～2000 bp图3 白粉病抗性基因Pm21标记在不同小麦种质中扩增Fig.3 Amplified result of the gene marker Pm21 resistant to powdery mildew in different wheat germplasma

成株期田间白粉病抗性鉴定表明(表5)，9个基因标记均未得以检测的材料3份材料病级均为7～8级，为高感白粉病；Pm2、Pm4a和Pm8基因中不论是携带单个基因或两、三个基因的材料，材料田间抗病性均表现为不同程度感病，病级大体上为5～8级，属于MS-HS，唯有材料13为2～3级，为HR-MR，材料28、45为4～5级，属于MR-MS；携带Pm6基因的材料大体上表现为抗病，病级为2～4级，属于HR-MR，而材料27、42、46为4～5级，为HR-MS；携带Pm21基因(其亲本均为南京农业大学细胞遗传所创建的细胞学材料92R-)的材料，不论是单基因或与其他基因互作，病级为0～2级，均表现为I-HR。

表5 小麦种质资源中不同白粉病抗性基因标记及抗病性鉴定

续表5 Continued table 5

编号CodePm2Pm4aPm6Pm8Pm21病级Disease grade抗病性Resistance编号CodePm2Pm4aPm6Pm8Pm21病级Disease grade抗病性Resistance21++—+—5～6MS62++—+—4～5MR-MS22++—+—5～6MS63++——+1～2HR23+——+—6～7MS-HS64++——+0;-1NI-HR24++—+—5～6MS65++——+0;-1NI-HR25++—+—7～8HS66+———+1～2HR26++—+—6～7MS-HS67++——+0;NI27+—+——4～5MR-MS68++——+0;NI28++—+—4～5MR-MS69++——+0;NI29+—++—3～4MR70++—++0I30+—++—3～4MR71++—++0I31+—++—4～5MR-MS72++——+0;NI32+——+—6～7MS-HS73++——+0;NI33+—++—3～4MR74+———+0;NI34+—++—3～4MR75++——+0;NI35+——+—7～8HS76+——++0;NI36+————7～8HS77++——+0;NI37+——+—7～8HS78+————6～7MS-HS38+——+—6～7MS-HS79++———5～6HS39+——+—6～7MS-HS80++—++0I40++++—2～3HR-MR81+—+——3～4MR41+————7～8HS

3 讨 论

作物遗传改良的突破性进展与所需种质资源的发现、开拓及其利用密切相关[33]。当今栽培小麦的遗传基础日趋狭窄、脆弱，不能适应高产、稳产和可持续发展的需要，小麦种质资源遗传多样性是其遗传改良的基础，特异种质资源的筛选、鉴定及利用是拓宽小麦遗传基础、提高育种效率、选育优良品种的重要途径。柴永峰等[34]对146份小麦种质的研究表明，产量、主茎穗长、穗粒数等性状变异系数较大。王光禄等[35]对国外引进的94份小麦种质的主要农艺性状变异系数分析发现，不孕小穗﹥有 效 穗 数﹥穗 粒 数﹥产量﹥株高﹥千粒重，其农艺性状的变异系数都较大。 刘新月等[36]对小麦产量构成因素进行分析，发现产量相关程度以有效穗数(0.834)为最大。本试验81份小麦种质的9个农艺性状指标进行分析表明，平均变异系数为7.19 %，依次为有效穗(14.77 %)﹥穗粒重(14.41 %)﹥穗粒数(8.94 %)﹥穗下茎长(7.03 %)﹥结实数(5.69 %)﹥小穗数(5.03 %)﹥穗长(4.98 %)﹥株高(3.21 %)﹥千粒重(0.65 %)，说明这81份小麦种质的艺性状上具有较大的变异潜力，这可能与材料亲缘关系和地理差异较远有关。同时，10项农艺性状指标间相关分析表明，穗下茎长有利于增加有效穗、穗长、小穗数和结实数，而不利于千粒重、经济系数和穗粒数的提高，说明穗下茎长对产量的直接贡献不大；有效穗与穗粒数、经济系数均呈极显著负相关，说明过多的分蘖使得群体间竞争加大、生物学产量增加，不利于提高穗粒数和经济系数，符合生产实际情况；穗长越长有利于小穗数、穗粒数的增多和提高粒重；小穗数和结实数越多，有利于提高单株粒数和粒重，而对整体产量的贡献不大，具体原因需要进一步明确；穗粒数与穗粒重、穗粒重分别与千粒重和经济系数、千粒重与经济系数均呈极显著正相关，说明粒数、粒重、千粒重、经济系数对产量贡献具有一致趋势，也是符合生产实情。聚类分析方法在研究作物种质资源的起源、差异和分类已广泛应用，通过对81份种质10项农艺性状指标的聚类分析将材料分为7个类群，各类群间差异明显。总体上，第Ⅰ类群多为一些古老地方品种，22份材料平均有效穗最多为(6.83±1.986)个；第Ⅱ类群基本上为一些育成品种，54份材料平均株高最矮为(83.94±13.429)cm，说明自矮秆和半矮秆基因在小麦育种中广泛利用，极大地提高了小麦的抗倒伏性及其单位面积的产量水平[37-39]，育种应用时可作为改良株高的中间亲本，所以，20世纪以来小麦品种的演变过程中，株高降低是一个显著的特点[40]；其他类群均仅包括1份材料，部分农艺性状表现突出，尤其第Ⅵ类群的提摩菲维小麦在穗长、穗粒数、穗粒重、千粒重、经济系数等指标均存在明显优势，在改良小麦穗部特性或提高产量方面表现出一定潜力，因此育种上可作为丰产材料加以利用。由于未对其品质性状进行分析，因此今后应对这些材料进行品质鉴定后，以筛选出综合性状较好的材料。

20世纪60 年代以来，随着矮秆品种的推广种植、氮肥施用量和种植密度增大，白粉病在世界主要麦区的危害日趋严重，也是我国小麦生产中最严重的病害之一。化学防治对小麦白粉病已取得一定的成效，但浪费人力、物力和财力，特别是会造成环境污染。因此，选育抗病品种是防治小麦白粉病最经济、有效的方法[3]。充分利用已发现的抗小麦白粉病基因，同时积极拓宽小麦遗传基础，挖掘出更多的抗白粉病新种质(新基因)，是目前小麦育种工作者的当务之急。抗小麦白粉病基因主要来源于普通小麦本身及其近缘种属，第一类来源于小麦属，其中Pm1 (a-d)、Pm4 (d-j)、Pm9、Pm10、Pm11、Pm14、Pm15、Pm18、Pm22、Pm23、Pm24、Pm28和Pm29 等来源于普通小麦；另外，如Pm2来源于阿拉拉特小麦；Pm4a和Pm5 来源于栽培二粒小麦；Pm4b来源于波斯小麦；Pm6和Pm27来源于提莫菲维小麦；Pm16、Pm26和Pm30 来自于野生二粒小麦；Pm25来源于野生一粒小麦；Mld来源于硬粒小麦，等。第二类来源于小麦近缘种属，包括Pm7、Pm8、Pm17和Pm20来源于栽培黑麦；Pm12来源于拟斯卑尔脱山羊草；Pm13来源于高大山羊草；Pm19来源于粗山羊草；Pm21来源于簇毛麦。这些抗性基因中，多数在染色体上有明确定位，如，Pm21、Pm31被定位于簇毛麦6VS[18,20,41]、Pm12在拟斯卑尔脱山羊草6S[42]、Pm20在栽培黑麦6RL[43]、Pm30在5BS[44]、MlZec1在2BL[45]、MllW72在7AL[46]、PmG3M在6BL[41]、Pm26和Pm47在2BS[11, 47]、Pm51在中间偃麦草渐渗系2BL[48]，等等。这些抗性基因在不同时期不同程度地提高了小麦抗白粉病的能力，尤其Pm21为表现出广谱、高效、持久的抗性，已广泛应用于国内小麦抗白粉病育种中。本试验利用9个白粉病抗性基因标记检测这些基因在81份小麦种质中的分布，其中，仅检测Pm2、Pm8的材料分别为10份、1份，聚合Pm2+Pm4a、Pm2+Pm6、Pm2+Pm8、Pm2+Pm21基因的材料分别为4、4、13、2份，聚合Pm2+Pm4a+Pm8、Pm2+Pm4a+Pm21、Pm2+Pm6+Pm8、Pm2+Pm8+Pm21基因的材料分别为16、10、10、2份，聚合Pm2+Pm4a+Pm6+Pm8、Pm2+Pm4a+Pm8+Pm21的材料分别有2、3份。同时，对材料进行成株期田间白粉病抗性鉴定，表明9个基因标记均未得以检测的材料4份材料病级均为6～8级感白粉病；Pm2、Pm4a和Pm8基因中不论是携带单个或多个基因聚合的材料田间抗病性均表现为不同程度感病，病级大体上为5～8级，属于MS-HS；携带Pm6基因的材料大体上表现为抗病，病级为2～4级，属于HR-MR；携带Pm21基因的材料，不论是单基因或与其他基因互作，病级大体在0～2级，表现为I-HR。但也有例外，材料13仅有Pm8基因标记得以检测，而病级为2～3级高抗至中抗，这可能与该材料携带的Pm17、Pm20抗性基因有关[14-17]；而材料28和45分别有Pm2、Pm4、Pm8和Pm2、Pm8基因标记得以检测，病级均为4～5级，属于MR-MS，材料27、42、46中Pm2和Pm6基因标记得以检测，病级为4～5级，为MR-MS，这可能与鉴定的植株数及所用抗性基因标记数量都偏少有关，今后抗病性分析中要扩大鉴定群体和增加基因标记数量。总体上，上述基因中Pm6、Pm21具有较好的抗白粉性，可以在抗病育种中加以利用，尤其Pm21抗性最强，抗谱最广，是中国目前使用最广泛的抗白粉病基因。