李 逊，魏慧梅，王 琴，余 蓉，郑永祥

(四川大学 华西药学院，四川 成都 610041)

多糖是生物体内一类重要的大分子物质，具有调节机体免疫的作用，特别在抗肿瘤、抗病毒、抗感染和抗氧化等方面具有良好的活性[1]。糖肽是多糖类物质的糖基和蛋白或多肽链的氨基共价键相连而形成的化合物。多糖类物质的生理作用与其结构中某些官能团或糖苷键的构型有关[2]，通过化学反应引入某些基团，如多糖硫酸酯化、乙酰化或甲基化等结构修饰均能够显著增加或增强多糖的生物活性[3]。多糖的修饰研究为新药研发提供了新思路，并为研究多糖类物质构效关系提供理论依据。

十二指肠糖肽由多种蛋白酶水解，猪的十二指肠黏蛋白后再提取制得，再经硫酸酯化反应得到硫酸糖肽，硫酸糖肽被证实具有刺激碳酸氢盐分泌、减少胃黏膜腐蚀、促进黏膜生长因子生成以及影响细胞循环、调控细胞增殖相关蛋白表达的药理作用[4-5]，因此，可作为抑制胃蛋白酶活性和胃黏膜溃疡的强保护剂，从而治疗胃、十二指肠溃疡和胃炎。张革[6]以氯磺酸为磺化剂，糖肽溶于吡啶进行硫酸酯化，产物的硫含量达14.8%，该方法采用的溶剂吡啶溶解度高但毒性强，工业化生产时对环境不友好，并存在一定安全问题。多糖修饰常用的溶剂有二甲基亚砜、苯类、吡啶、甲酰胺和二甲基甲酰胺等。其中，甲酰胺具有低毒、环保和经济等优点，越发受到多糖修饰研究的青睐，常用的酯化剂有氯磺酸、三氧化硫、发烟硫酸和氨基磺酸等[7]。

本研究中，笔者旨在确立一种环保、经济且条件易控制的十二指肠糖肽硫酸酯化方法。选用甲酰胺为溶剂，对比氯磺酸和氨基磺酸2种酯化剂的酯化效率，对氨基磺酸法进行了工艺优化，用琼脂糖电泳和红外光谱分析对产物加以鉴定，以期为促进肠糖肽的修饰研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

十二指肠糖肽(CR)，Sigma公司；氨基磺酸、氯磺酸(AR)，成都市科龙化工试剂厂；甲酰胺(AR)，天津市致远化学试剂有限公司；琼脂糖(BR)，BIOWEST公司；肝素钠(BR)，上海源叶生物技术有限公司；巴比妥钠、甲苯胺蓝、溴酚蓝、十六烷基三甲基溴化铵(BR)，BIOSHARP公司。

1.2 主要仪器

FA2004型电子天平，HANGPING公司；GD65-1型鼓风干燥箱，北京市朝阳区来广营医疗器械；8302型恒温水浴锅，北京市长风仪器仪表公司；旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司；SHB-3型循环水真空泵，郑州杜甫仪器厂；81-2型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器厂；VECTOR 22型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)，Bruker公司；PYCP-31C型电泳槽、DYY-Ⅲ2型稳压稳流电泳仪，北京市六一仪器厂。

1.3 酯化剂筛选

1)溶解：将十二指肠糖肽在60 ℃水浴中溶解于甲酰胺，用磁力搅拌器搅拌至糖肽完全融化，成均一液体。

2)磺化反应：在冰盐浴中，用分液漏斗将氯磺酸缓慢滴入甲酰胺中成混酸溶液，温度控制在20～30 ℃。在冰盐浴中将混酸溶液用分液漏斗缓慢滴入溶液，控制温度在40 ℃以下，或加入称量好的氨基磺酸固体。氯磺酸法需向烧瓶中充入氩气(Ar)保护，在60 ℃水浴中反应6 h。

3)终止反应：向反应体系中加入NaOH调pH至7，混匀的同时加入4倍体积的乙醇，4 ℃条件下静置。

4)分级醇沉：将静置后的混合液用G-3漏斗过滤，收集沉淀置于50 ℃干燥箱。用10倍蒸馏水溶解，调pH至7，再加4倍体积乙醇，4 ℃沉淀6 h以上，离心分离沉淀。重复3次。

5)氧化除氨：将干燥后的沉淀加约10倍水溶解，再加总体积5%的H2O2，氧化3 h，加入质量分数1%的NaCl固体，用NaOH调pH至10，加少量Na2CO3，维持pH 10。在60 ℃水浴条件下搅拌除NH3。用湿润试纸检测除氨效果。

6)沉淀：待滤纸不变色，加入乙醇，使最终体积分数为70%。4 ℃静置3 h后抽滤，收集沉淀，加入9倍质量的水和0.7倍质量的NaCl固体，调pH至6～7。加入乙醇，使得终体积分数为75%。

7)洗涤干燥：抽滤，收集沉淀，加3倍乙醇搅拌0.5 h，浸泡3 h后抽滤，收集沉淀，50 ℃烘干。

图1 酯化反应流程Fig.1 The esterification reaction process

1.4 磺化产物硫含量计算

S=m(BaSO4)/m(硫酸糖肽)×0.137 3×100%

(1)

式中：m(BaSO4)为BaSO4的质量；m(硫酸糖肽)为硫酸糖肽的质量；0.137 3为硫磺的原子量与BaSO4的分子量之百分比。

1.5 氨基磺酸-甲酰胺法工艺单因素分析

采用单因素实验对影响氨基磺酸-甲酰胺法硫酸酯化工艺的几项因素进行研究，以产物硫含量为衡量指标，考察糖肽和磺化剂之质量比(1∶ 2、1∶ 4、1∶ 6、1∶ 8和1∶ 10)、糖肽和甲酰胺的料液比(1∶ 5、1∶ 7、 1∶ 9、 1∶ 11和1∶ 13 g/L)、酯化时间(4、5、6、7和8 h)和酯化温度(50、60、70、80 和 90 ℃)对工艺的影响。

1.6 四因素四水平正交试验

通过单因素实验，对影响氨基磺酸法酯化效果的4个因素确定了合理范围，在此基础上，进行四因素四水平的正交试验，以分析多重影响因素作用下的最佳工艺条件。

1.7 硫酸酯化产物琼脂糖凝胶电泳分析

电极缓冲液：0.05 mol/L 巴比妥钠-盐酸缓冲液，pH 8.0；染色液：0.01%甲苯丙胺蓝溶液；指示剂：0.1%溴酚蓝溶液；0.1%十六烷基三甲基溴化铵溶液(CTAB)；肝素钠标准液、样品溶液均为10 mg/mL。

以巴比妥钠-盐酸缓冲液为溶剂，配制质量比1.0%的琼脂糖凝胶，加热制胶[8]。各取8 μL样品、标准品和溴酚蓝指示剂在负极上样。在10 V/cm电压下开始电泳，电泳结束后将凝胶在CTAB溶液中固定2 h，取出用滤纸吸干凝胶表面的水分，最后将凝胶置于染色液染色10 min，用蒸馏水脱色过夜。脱色后利用软件Visioncapt计算各样品迁移率。

1.8 红外光谱对比分析

称取十二指肠糖肽原料和氨基磺酸法硫酸酯化产物各2 mg，分别与150 mg干燥的KBr混合，在玛瑙研钵中研磨均匀然后压片，在500～4 000 cm-1区间内扫描红外吸收光谱。

2 结果与讨论

2.1 酯化剂筛选结果

以甲酰胺为溶剂，在反应温度60 ℃、酯化时间6 h及糖肽与甲酰胺的料液比分别为1∶ 7、1∶ 8和1∶ 9 g/L条件下，进行了3组平行实验，分别以氯磺酸和氨基磺酸为磺化剂的磺化效果，结果见图2。

图2 氯磺酸法与氨基磺酸法对硫酸酯化产物 硫含量的影响Fig.2 Effects of chlorosulfonic acid and sulfamic acid on sulfur content of sulfate esterification product

由图2可知：在60 ℃、反应6 h条件下，氯磺酸法酯化产物的S含量高于20%，氨基磺酸法产物的S含量最高为14.72%，均高于文献报道中的同类糖肽其他酯化方法[6,9]，可见甲酰胺作为溶剂较吡啶等能够提高多糖类物质硫酸酯化效率，且环保低毒。

虽然在该工艺条件下氨基磺酸法磺化率略低，但相比于氯磺酸合成硫酸酯化糖肽，前者反应过程更加温和，无需缓慢滴加酸液，磺化产物外观性状更好(颜色浅且粉末质地均匀)，随着甲酰胺溶剂增加和其他反应条件的优化，磺化率有望进一步提高。

综上，考虑到环保、经济等因素，认为氨基磺酸-甲酰胺法更具研究潜力，继而进行了工艺的优化。

2.2 氨基磺酸法单因素实验

2.2.1 氨基磺酸用量对酯化效果的影响

磺化剂用量是硫酸酯化反应产物酯化率的重要因素之一，一般而言，磺化剂与底物质量比越高，产物磺化反应越充分，但过量磺化剂导致体系酸性过强，糖肽原料分解，造成产物S含量降低。在糖肽和甲酰胺的料液比1∶ 10(g/L)、反应温度70 ℃、反应时间6 h的条件下，考察糖肽和磺化剂质量之比(1∶ 2、1∶ 4、1∶ 6、1∶ 8和1∶ 10)对酯化效果的影响，结果见图3。由图3可知：磺化产物中的S含量随磺化剂用量增大而升高，在糖肽和磺化剂之质量比为1∶ 6时最高，为14.13%。故糖肽和磺化剂之质量比最适比例为1∶ 8左右。

图3 氨基磺酸用量对酯化效果的影响Fig.3 Effect of mass ratio of glycopeptide to sulfamateon sulfation rates

2.2.2 甲酰胺用量对酯化效果的影响

甲酰胺用量决定了糖肽分子在溶剂中的溶解程度，甲酰胺体积越大，底物溶解越充分。在糖肽和氨基磺酸质量比为1∶ 8、反应温度70 ℃、反应时间6 h的条件下，考察糖肽和甲酰胺的料液比(1∶ 5、1∶ 7、1∶ 9、1∶ 11和1∶ 13 g/L)对酯化效果的影响，结果见图4。由图4可知：当糖肽和甲酰胺的料液比小于1∶ 11时，磺化产物中的S含量随甲酰胺用量增加而升高显著，而当糖肽和甲酰胺的料液比增加至1∶ 11后，磺化产物中的S含量增加不明显；糖肽和甲酰胺的料液比低于1∶ 7时，这时糖肽无法完全溶解，固-液相反应导致糖肽和磺化剂分子间不能充分接触，故磺化产物中的S含量低，考虑到工艺中对溶剂后处理和成本因素，故糖肽和甲酰胺料液比的最适比例为1∶ 10。

图4 甲酰胺用量对酯化效果的影响Fig.4 Effect of mass ratio of glycopeptide mass to formamide volume on sulfation rates

2.2.3 酯化时间对酯化效果的影响

反应时间越长，酯化反应程度越充分，过度延长反应时间则导致硫酸酯化产物降解和副反应的发生。在糖肽和氨基磺酸质量之比1∶ 8、糖肽和甲酰胺的料液比1∶ 10(g/L)、反应温度70 ℃的条件下，考察酯化时间(4、5、6、7和8 h)对酯化效果的影响，结果见图5。由图5可知：酯化时间对酯化产物中的S含量影响较大，当反应时间低于5 h时，由于反应不充分，所以产物中的S含量较低；随着反应时间的延长，产物中的S含量随之增加，在7 h左右达到最高，磺化产物中的S含量达14.14%；当酯化时间超过7 h后，产物中的S含量降低至14.01%，这可能是因为磺化产物发生降解或反应时间过长导致副反应发生。因此，最适酯化反应时间为6 h左右。

图5 酯化时间对酯化效果的影响Fig.5 Effect of reaction time on sulfation rates

图6 酯化反应温度对酯化效果的影响Fig.6 Effect of reaction temperature on sulfationrates

2.2.4 酯化温度对酯化效果的影响

反应温度也是影响酯化反应的重要因素，高温有助于反应更充分，但温度过高会造成底物和产物的分解。在糖肽和氨基磺酸质量比为1∶ 8、糖肽和甲酰胺的料液比为1∶ 10(g/L)、反应时间6 h的条件下，考察酯化温度(50、60、70、80 和 90 ℃)对酯化反应的影响，结果见图6。由图6可知:酯化产物中的S含量随着反应温度增加而增加，从8.31%提升至14.22%，但在酯化温度达到70 ℃后，增加不明显。考虑到高温不易控制耗能大、避免糖肽糖肽发生降解，故选定最适酯化温度为80 ℃。

2.3 正交试验结果

单因素实验确定的最佳条件范围是糖肽和磺化剂的质量比为1∶ 8、糖肽和甲酰胺的料液比为1∶ 10 g/L、酯化时间7 h、酯化温度80 ℃，以此设计了四因素四水平正交试验，实验设计及结果见表1，相关分析见表2。

表1 L16(44)正交试验设计及结果

表2 直观分析表

由表1和表2可知：氨基磺酸-甲酰胺法工艺效果的影响因素从强到弱为氨基磺酸量>酯化时间>酯化温度>甲酰胺量，最佳工艺条件为A3B4C1D3，即温度80 ℃、时间7 h、糖肽和甲酰胺的料液比1∶ 7、糖肽和氨基磺酸质量比1∶ 5。在此优势条件综合影响下，氨基磺酸-甲酰胺法磺化产物的S含量可提升至20%以上，与氯磺酸磺化效果相当。

2.4 琼脂糖电泳鉴定

对酯化产物利用琼脂糖电泳进行鉴定，结果见图7。以整个泳道长度为基准1，肝素钠标准品(lane 4)作为对照。由图7可知，虽然琼脂糖凝胶浓度、上样量等因素均会对电泳结果影响，但相对迁移率稳定，可作为参考指标考察酯化产物的分子量。

1为肠糖肽原料；2为氯磺酸法酯化产物；3为氨基磺酸法酯化产物；4为肝素钠标准品(1.2×104)图7 琼脂糖电泳鉴定糖肽原料和硫酸酯化产物Fig.7 Determination of duodenum glycopeptide and sulfate esterification product by agarose electrophoresis

利用凝胶成像分析软件Visoncapt计算不同样品迁移率，得到肠糖肽原料(lane1)、氯磺酸法酯化产物(lane 2)、氨基磺酸法酯化产物(lane 3)、肝素钠标准品的迁移率(lane 4)分别为0.553、0.477、0.478和0.566，根据迁移率比换算糖肽原料和酯化产物的分子量分别约为1.011×105和1.173×105。酯化产物的迁移率低于肠糖肽原料，可见其分子量增大约6.0×103，证明糖肽分子结构发生改变，糖肽分子醇羟基上的—H发生磺化反应后替换为—SO3H基团。

2.5 糖肽及其硫酸酯化产物红外光谱分析

对糖肽及其硫酸酯化产物进行红外光谱鉴定，结果见图8。

图8 糖肽及其磺化产物红外光谱分析Fig.8 Infrared spectra analysis of glycopeptide and its esterification product

3 结论

致谢:感谢四川德博尔制药有限公司给予本项研究协助。